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绵羊是一种皮毛肉兼用型经济动物，随着饲养规模的不断扩大，一些病原性疾病如大肠杆菌病、球虫病等多发，虽然抗生素或化学药物能预防和治疗这些疫病，但长期使用一方面会破坏动物胃肠道内正常菌群的平衡、造成胃肠道菌群紊乱，另一方面会使动物机体产生耐药性。近年来，微生态制剂被畜牧行业广泛关注，也引起了广大科研人员的高度重视。微生态制剂在动物疾病防治方面有着抗生素和化学药物无法比拟的优势，不仅能够增强动物的免疫力且效果显著，能大大提高饲喂动物的经济效益。本研究将经过筛选的植物乳酸杆菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌混合制成微生态制剂，添加到断奶湖羊的饲粮中，分析了其对断奶羔羊生长性能、胃肠道菌群和机体免疫的影响;并且对试验羔羊人工感染球虫，研究了微生态制剂对羔羊体重、粪便状态、球虫卵囊排出情况和综合免疫指标含量变化的影响。本研究分为三个试验部分。
试验一:试验菌株的分离鉴定与功能性测定。本试验从健康绵羊肠道中分离菌株，并结合实验室保存菌株，通过形态学、生化试验和16S、26SrRNA基因扩增等分子生物学方法对分离的菌株进行鉴定，对分离菌株的生长曲线、耐酸性、耐胆盐性、产酶能力、抑制病原菌能力、药物敏感性和安全性等功能进行测定。结果显示，分离的菌株ECL1.2、R、13和J分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和毕赤酵母(Pichia manshurica);菌株ECL1.2、R、13和J的对数生长期分别为16-24h、8-20h、12-24h和8-24h;四株菌均具有良好的耐酸性和耐胆盐性;菌株ECL1.2具有良好的产纤维素酶、蛋白酶和α-淀粉酶的能力;菌株ECL1.2、R和13均可抑制病原菌大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus);菌株ECL1.2、R和13对八种常见抗生素(诺氟沙星、万古霉素、林可霉素、利福平、克拉霉素、庆大霉素、青霉素、头孢唑啉)敏感;菌株ECL1.2、R、13和J混合制成的微生态制剂对小鼠安全无毒副作用。
试验二:微生态制剂对断奶羔羊生长性能、胃肠道菌群及机体免疫的影响。选取20只体重、日龄相近的健康湖羊，随机分为4组，每组5只。将研制的微生态制剂分别按低(4×108CFU/只/d)、中(4×109CFU/只/d)、高(4×1010CFU/只/d)剂量拌料饲喂断奶羔羊，饲喂28d后屠宰，对断奶羔羊的生长性能、血液常规指标和免疫相关等指标进行检测，并通过IlluminaMiSeq高通量测序技术对断奶羔羊的瘤胃、十二指肠、盲肠和直肠内容物进行细菌群落的Alpha多样性和群落构成等进行分析。结果发现:1、添加微生态制剂到饲粮中可提高断奶羔羊的平均日增重，降低料重比，提高饲料的转化率。2、添加不同剂量的微生态制剂均可不同程度的提高断奶羔羊血浆的中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、白细胞、淋巴细胞和单核细胞数量。3、添加微生态制剂能增加断奶羔羊瘤胃微生物群落的多样性;降低断奶羔羊十二指肠和盲肠微生物群落的多样性，使十二指肠、盲肠内群落组成结构更加集中;对断奶羔羊直肠微生物群落的多样性影响不大;提高断奶羔羊瘤胃、十二指肠、盲肠和直肠内有益菌群的相对丰度，降低有害菌群的相对丰度。4、添加微生态制剂可提高断奶羔羊的胸腺指数，提高血清IFN-γ、IL-2和IgG含量，降低血清TNF-α、TNF-β和IL-4含量。5、添加微生态制剂可使断奶羔羊十二指肠、回肠和空肠的平均隐窝深度极显著增加(p＜0.01);对十二指肠、回肠和空肠的隐窝密度无显著影响(p＞0.05)。
试验三:微生态制剂对断奶羔羊人工感染球虫的影响。选取30只体重、日龄相近的健康湖羊，随机分为微生态制剂低(4×108CFU/只/d)剂量组、微生态制剂中(4×109CFU/只/d)剂量组、微生态制剂高(4×1010CFU/只/d)剂量组、球虫组、治疗组和空白对照组6组，每组5只。饲喂断奶羔羊14d后，除空白对照组外，其余5组人工感染羊艾美尔球虫卵囊105个/只，于排卵高峰期连续两天给治疗组灌服地克珠利溶液1mg/kg，攻虫后三周内每两日采集粪便，显微镜下观察每组排出球虫卵囊情况，期间观察羔羊的粪便状态、对羔羊的体重、血液常规指标和免疫等相关指标进行检测。结果显示:1、球虫感染可使断奶羔羊体重降低，料重比增加，出现腹泻。微生态制剂添加到断奶羔羊饲粮中可减小球虫对其生长性能的降低、减轻球虫感染所致的腹泻，其中中剂量微生态制剂组效果最佳。2、微生态制剂可以减少断奶羔羊感染球虫的风险，降低粪便中球虫卵囊的数量。3、断奶羔羊人工感染球虫后，羔羊血液中白细胞、中性粒细胞数量的升高，红细胞数量减少，血红蛋白浓度降低;添加微生态制剂可降低球虫感染引起的白细胞和淋巴细胞数量的升高程度，减少球虫感染引起的红细胞和血红蛋白浓度的降低程度，其中添加微生态制剂的中剂量效果最佳。4、与空白对照组相比，感染球虫可使断奶羔羊的血清IFN-α含量显著降低(p＜0.05);与球虫组相比，微生态制剂可使断奶羔羊血清IFN-γ和IL-2含量显著提高(p＜0.05)，血清TNF-α、TNF-β和IL-4含量显著降低(p＜0.05)。
综上所述，本研究用枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌、乳酸乳球菌和毕赤酵母混合制备的微生态制剂，添加到断奶羔羊饲粮中可提高羔羊的生长性能、改善血液质量;对羔羊瘤胃、十二指肠、盲肠和直肠的微生物菌群多样性有一定的影响，提高瘤胃和各肠段有益菌的数量、降低有害菌的数量;增强羔羊机体的免疫功能和肠道的吸收功能;提高断奶羔羊抗球虫病的能力。本研究的试验结果为微生态制剂在实际生产中应用提供了数据支撑，为动物养殖业的健康发展提供了理论指导。
试验一:试验菌株的分离鉴定与功能性测定。本试验从健康绵羊肠道中分离菌株，并结合实验室保存菌株，通过形态学、生化试验和16S、26SrRNA基因扩增等分子生物学方法对分离的菌株进行鉴定，对分离菌株的生长曲线、耐酸性、耐胆盐性、产酶能力、抑制病原菌能力、药物敏感性和安全性等功能进行测定。结果显示，分离的菌株ECL1.2、R、13和J分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)、植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和毕赤酵母(Pichia manshurica);菌株ECL1.2、R、13和J的对数生长期分别为16-24h、8-20h、12-24h和8-24h;四株菌均具有良好的耐酸性和耐胆盐性;菌株ECL1.2具有良好的产纤维素酶、蛋白酶和α-淀粉酶的能力;菌株ECL1.2、R和13均可抑制病原菌大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus);菌株ECL1.2、R和13对八种常见抗生素(诺氟沙星、万古霉素、林可霉素、利福平、克拉霉素、庆大霉素、青霉素、头孢唑啉)敏感;菌株ECL1.2、R、13和J混合制成的微生态制剂对小鼠安全无毒副作用。
试验二:微生态制剂对断奶羔羊生长性能、胃肠道菌群及机体免疫的影响。选取20只体重、日龄相近的健康湖羊，随机分为4组，每组5只。将研制的微生态制剂分别按低(4×108CFU/只/d)、中(4×109CFU/只/d)、高(4×1010CFU/只/d)剂量拌料饲喂断奶羔羊，饲喂28d后屠宰，对断奶羔羊的生长性能、血液常规指标和免疫相关等指标进行检测，并通过IlluminaMiSeq高通量测序技术对断奶羔羊的瘤胃、十二指肠、盲肠和直肠内容物进行细菌群落的Alpha多样性和群落构成等进行分析。结果发现:1、添加微生态制剂到饲粮中可提高断奶羔羊的平均日增重，降低料重比，提高饲料的转化率。2、添加不同剂量的微生态制剂均可不同程度的提高断奶羔羊血浆的中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、白细胞、淋巴细胞和单核细胞数量。3、添加微生态制剂能增加断奶羔羊瘤胃微生物群落的多样性;降低断奶羔羊十二指肠和盲肠微生物群落的多样性，使十二指肠、盲肠内群落组成结构更加集中;对断奶羔羊直肠微生物群落的多样性影响不大;提高断奶羔羊瘤胃、十二指肠、盲肠和直肠内有益菌群的相对丰度，降低有害菌群的相对丰度。4、添加微生态制剂可提高断奶羔羊的胸腺指数，提高血清IFN-γ、IL-2和IgG含量，降低血清TNF-α、TNF-β和IL-4含量。5、添加微生态制剂可使断奶羔羊十二指肠、回肠和空肠的平均隐窝深度极显著增加(p＜0.01);对十二指肠、回肠和空肠的隐窝密度无显著影响(p＞0.05)。
试验三:微生态制剂对断奶羔羊人工感染球虫的影响。选取30只体重、日龄相近的健康湖羊，随机分为微生态制剂低(4×108CFU/只/d)剂量组、微生态制剂中(4×109CFU/只/d)剂量组、微生态制剂高(4×1010CFU/只/d)剂量组、球虫组、治疗组和空白对照组6组，每组5只。饲喂断奶羔羊14d后，除空白对照组外，其余5组人工感染羊艾美尔球虫卵囊105个/只，于排卵高峰期连续两天给治疗组灌服地克珠利溶液1mg/kg，攻虫后三周内每两日采集粪便，显微镜下观察每组排出球虫卵囊情况，期间观察羔羊的粪便状态、对羔羊的体重、血液常规指标和免疫等相关指标进行检测。结果显示:1、球虫感染可使断奶羔羊体重降低，料重比增加，出现腹泻。微生态制剂添加到断奶羔羊饲粮中可减小球虫对其生长性能的降低、减轻球虫感染所致的腹泻，其中中剂量微生态制剂组效果最佳。2、微生态制剂可以减少断奶羔羊感染球虫的风险，降低粪便中球虫卵囊的数量。3、断奶羔羊人工感染球虫后，羔羊血液中白细胞、中性粒细胞数量的升高，红细胞数量减少，血红蛋白浓度降低;添加微生态制剂可降低球虫感染引起的白细胞和淋巴细胞数量的升高程度，减少球虫感染引起的红细胞和血红蛋白浓度的降低程度，其中添加微生态制剂的中剂量效果最佳。4、与空白对照组相比，感染球虫可使断奶羔羊的血清IFN-α含量显著降低(p＜0.05);与球虫组相比，微生态制剂可使断奶羔羊血清IFN-γ和IL-2含量显著提高(p＜0.05)，血清TNF-α、TNF-β和IL-4含量显著降低(p＜0.05)。
综上所述，本研究用枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌、乳酸乳球菌和毕赤酵母混合制备的微生态制剂，添加到断奶羔羊饲粮中可提高羔羊的生长性能、改善血液质量;对羔羊瘤胃、十二指肠、盲肠和直肠的微生物菌群多样性有一定的影响，提高瘤胃和各肠段有益菌的数量、降低有害菌的数量;增强羔羊机体的免疫功能和肠道的吸收功能;提高断奶羔羊抗球虫病的能力。本研究的试验结果为微生态制剂在实际生产中应用提供了数据支撑，为动物养殖业的健康发展提供了理论指导。