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再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA)简称再障,是一组由化学、物理、生物、药物及不明因素引起的骨髓造血干/祖细胞与造血微环境损伤,导致骨髓造血功能衰竭及外周血全血细胞数量减少的一种疾病。由于病因及发病机制尚未完全明确,故治疗较困难,是儿童常见的难治性血液病之一。再障发病机理较为复杂,以往学者多认为,造血干细胞损伤、造血微环境缺陷和免疫介导因素导致了再障的发生,此三种发病机制在不同的患者体内单独存在或联合作用,导致造血功能衰竭。目前越来越多的临床及实验室研究证实,免疫系统的紊乱包括T淋巴细胞数量和功能异常所造成的造血抑制,在AA的发生、发展中起着重要的作用。临床资料显示约70%左右再障患者应用免疫抑制剂如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)/抗淋巴细胞球蛋白(ALG)及环孢菌素(CsA)治疗有效,提示了免疫功能异常因素介导的造血抑制在再障发病中的重要作用。近年来CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)引起国内外学者的广泛关注,它在维持外周免疫耐受中起着重要作用。临床研究发现,CD4+CD25+Treg细胞与多种自身免疫性疾病、移植排斥、肿瘤及病毒感染相关。国外有学者研究表明,CD4+CD25+T淋巴细胞被分为三个表型：CD25high+、CD25intermediate+和CD25low+。具有免疫抑制功能的Tregs高表达IL-2Rα(CD25),另外也表达转录因子Foxp3,其表型显示为CD4+CD25high。最近国内学者在分析中国健康人外周血中CD4+CD25+Treg细胞表达频率时,采用三色免疫荧光染色分析技术分选了具有CD4+CD25int/highCD127low表达特征的细胞群。经胞内Foxp3染色的结果亦证实：CD25int/highCD127low表达的细胞Foxp3阳性,而CD25lowCD127high细胞几乎全部Foxp3表达阴性。由此提示CD25int/highCD127low可作为Treg细胞表面的特征性标志物而用于Treg的分选。转录因子Foxp3及活化的T细胞核因子(NFAT)在Treg的发育和分型中起重要的作用。有实验证实：Foxp3决定了调节性T细胞的抑制功能,且Foxp3可能通过翻译水平来改变调节性T细胞的抑制功能。活化T细胞核因子(NFAT)是T细胞受体(TCR)介导的信号转导通路中非常关键的转录因子。NFAT家族主要包括NFAT1、NFAT2、NFAT3和NFAT4四个成员。Solomou等发现：再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞中Treg的表达降低,Foxp3在蛋白水平和mRNA水平也是显著降低的,同时伴随着NFAT1蛋白的降低,并且NFAT1蛋白的低表达可能可以解释Foxp3的低表达和Treg的减少频率。而目前国内关于Foxp3、NFAT1蛋白在儿童再障发病机制中的作用、两者之间的关系及其与再障预后的联系尚少见报道。目的本研究应用流式细胞术、免疫印迹试验(Western-blotting)的方法检测慢性再障(CAA)患儿及正常儿童外周血单个核细胞中Treg细胞及在其发育和分型中起重要作用的转录因子Foxp3及NFAT1在蛋白水平的表达,探讨它们之间的相互关系及在再障的免疫学发病机制中的原理,为再障的防治提供可行思路,并为探究再障的免疫抑制治疗方法提供可能的理论依据。材料与方法1研究对象收集郑州大学第三、第一附属医院2009年10月至2010年6月儿科住院及门诊的慢性再障患儿,将其分成两组：初治期22例和恢复期22例,每组中男12例,女10例,年龄2-11岁；正常对照组为我院外科近期无感染、无免疫相关性疾病患儿,共计15例,男8例,女7例,年龄1-11岁,其体检各项指标均在正常范围内。各组之间年龄差异均无统计学意义(P>0.05)(见表3.1)。诊断及疗效标准均符合《小儿再障诊疗建议》,所有恢复期患儿均不需输血。2方法应用流式细胞术检测外周血CD4+CD25int/highCDl 27low Treg细胞的表达水平；提取外周血单个核细胞,并提取该细胞中的总蛋白,用Western-blotting的方法检测NFAT1、Foxp3蛋白的表达水平,实验所得的X光片结果应用扫描仪进行扫描,应用Quanity One软件分析图片中目的条带的平均灰度及背景灰度,前者减去后者作为统计分析的数值,各样品的最后统计数值为其灰度值与相应内参灰度值之比。3统计学处理采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理,所有原始数据均进行正态性、方差齐性检验,实验数据均以均数±标准差(x±s)表示,多样本均数间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间比较分析采用LSD-t法,各变量之间的相关性分析采用Pearson相关检验,以α=0.05为检验水准。结果1.CAA初治期患儿外周血中CD4+CD25+、CD4+CD25high、CD4+CD25+CD127low、CD4+CD25highCD127low占CD4+T细胞的百分比均较对照组降低(P<0.05)；恢复期的表达则较初治期升高(P<0.05),而与对照组差异无统计学意义(P>0.05)2.CAA初治期患儿外周血单个核细胞中Foxp3、NFAT1蛋白的表达水平分别为0.86±0.06、0.77±0.08；较对照组明显降低(P<0.05)；恢复期的表达水平分别为1.20±0.26、1.11±0.12；较初治期明显升高(P<0.05)。3.相关性分析(1)CAA患儿CD4+CD25highCD127low调节性T细胞与外周血单个核细胞内Foxp3、NFAT1蛋白的表达均呈正相关(r分别为0.857,0.880,P<0.05)。(2) CAA患儿外周血单个核细胞内Foxp3与NFAT1蛋白的表达呈正相关(r=0.807,P<0.05)。结论1.CAA患儿外周血CD4+CD25int/highCD127lowTreg细胞和NFAT1、Foxp3蛋白表达均降低,有可能在慢性再障的发病过程中起重要作用,且初治期表达低于恢复期,有望用于再障疗效的评估。2. Foxp3与NFAT1蛋白表达水平呈正相关,说明两者在Treg的发育和分化中起协同作用。