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乳腺癌主要起源于乳腺导管上皮,是女性中最常见的恶性肿瘤,全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌,有50万妇女死于乳腺癌。且发病率正逐年上升。手术治疗仍然是非转移性乳腺癌的主要治疗方法之一。自从上个世纪五十年代Fisher等提出乳腺癌是一种全身性疾病,系统性内科治疗在乳腺癌治疗中的地位就开始得到广泛的重视。大量的临床试验结果显示,辅助性化疗使乳腺癌死亡率下降约25%,辅助性内分泌治疗可使死亡率下降30%～40%。这些研究结果进一步奠定了辅助性治疗在乳腺癌治疗中的重要地位,乳腺癌治疗的重点已从以往的单纯手术向含系统性治疗在内的综合性治疗发展。乳腺癌易发生远处转移,即使是小于2cm的肿块,远处转移的发生率也较高。目前的检查手段(如CT、MRI、超声、骨扫描等)一般只能查出1cm以上的转移灶,难以早期了解病人是否已存在远处转移,因而很难有的放矢地实施预见性治疗方案。近年来,出现了免疫细胞化学和RT-PCR法检测各类癌症病人骨髓和外周血中的循环肿瘤细胞,提供了乳腺癌病人科学分期的新方法。对已存在微小转移的病人,尽早地进行全身治疗,再进行局部的手术治疗,即诱导化疗或诱导内分泌治疗。消灭隐匿病灶,是治疗成功的关键。一般情况下,血液中是不存在上皮细胞的。若外周血检出上皮抗原如CK系列等,说明存在上皮来源的细胞,最可能是癌细胞。国内外近年来已有多篇有关RT-PCR检测血液中循环肿瘤细胞的文章,对此项测定有争议,因为:静脉穿刺皮肤细胞沾染可导致正常血液假阳性,外周血白细胞有非法转录等。本课题以消除假阳性和非法转录为切入点,首先建立成熟的RT-PCR反应体系和条件。然后,通过观察各期乳腺癌外周血CK19的阳性率,探讨循环肿瘤细胞与临床分期的关系。以期为临床分期和化疗提供一个有价值的参考指标。方 法: 1、外周静脉血的采取 室温下放置的采血管使用前,标记好病人号。采用标准穿刺技术,垂直拿管,低于病人手臂。为防止表皮细胞沾染,不能是第一管血,废弃管接开始和最后的血液,只有中段1.5ml血样用于分析。移管前确保不再流血。采血后轻柔地摇晃采血管6次。血样采集后存放于4℃冰箱,不超过5天。 <WP=6> 2、RNA制备 1.5ml血样加红细胞裂解液,混匀,1400rpm离心5分钟,弃上层液体。沉淀中加1ml白细胞裂解液,抽打。加氯仿,混匀,取上清。加入等体积(0.5ml)异丙醇,混匀,上吸附柱,低温高速离心。加0.5ml RP液入柱,低温高速离心,移柱入新的收集管中,加入0.5ml W3液,低温高速离心90秒。移柱入新的1.5ml离心管,柱膜中央加50μl纯水,低温高速离心,含RNA的离心管冻存于-70℃。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,分光光度计检测总RNA A260和A260/A280。 3、引物设计和合成 根据KRT19(CK19)mRNA序列,使用“Premier Primer 5”和“Oligo 6”软件设计引物,再到核酸数据库比对。引物由申友生物技术有限公司合成。 4、一步法RT-PCR 先做阳性对照一步法RT-PCR实验例。然后使用抽提的RNA样品做一步法RT-PCR,GAPDH作内对照。反应体系为50μl,构成如下:5μl RNA PCR 缓冲液,10μl Mgcl(25m M),5μl dNTP 混合物(10mM),1μlRNA酶抑制剂(40u/μl),1 μl AMV反转录酶 XL(5u/μl),1 μl AMV-Optimized Taq DNA多聚酶(5 u/μl),1 μl上游特异性引物 (20μM),1 μl下游特异性引物(20μM),10μl 抽提RNA,15μl 不含RNA酶的水。反应条件:50℃下30分钟反转录,94℃下2分钟灭活反转录酶,94℃下30秒变性,60℃下30秒退火,72℃下1.5分钟延伸,做25～40个循环。5μl RT-PCR 反应液做1.5%琼脂糖凝胶电泳和溴已锭染色。 5、测序 将RT-PCR扩增产物送测序。 6、扩大样本检测 所有研究对象分成3组。组1的血样来自77例乳腺癌I/Ⅱ期乳腺癌病人,组2的血样来自77例Ⅲ/Ⅳ期乳腺癌病人,40例普通门诊病人(非癌患者)的血样做对照组。 7、统计分析:用卡方检验判断乳腺癌分期和CK19 mRNA表达的关系。显著性定义为P <0.05。结果: 1、混有0.25ml ACD抗凝剂的1.5ml静脉血采取顺利,无凝血或溶血。 2、小量血总RNA快速抽提试剂盒抽提的总RNA经1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色,紫外灯下可见清晰的18S rRNA,28S rRNA带。测得的A260/A280在1.9和2.1之间,表明RNA纯度较高。A260 OD值在0.2和0.3之间,相应的RNA浓度为320～480μg/ml,符合RT-PCR要求。 <WP=7> 3、设计的引物对为Primer A (bp453):5’-TGTCCTGCAGATCGACAATG-3’,Primer B (bp766C):5’-ATTGGCTTCGCATGTCACTC-3’。到核酸数据库比对证实是CK19的特异性引物,计算扩增产物的长度为314bp。引物由上海申友生物技术有限责任公司合成。 4、退火温度为60℃,循环数为30时,转移性乳腺癌患者样本1.5%琼脂糖凝胶电泳显示清晰的314bp的PCR产物条带,而正常人血样无条带。 5、RT-PCR产物经测序证实为CK19的特异片段。序列:atccaggacctgcgggacaagattcttggtgccaccattgagaactccaggattgtcctgcagatcgacaatgcccgtctggctgcagatgacttccgaaccaagtttgagacggaacaggctctgcgcatgagcgtggaggccgacatcaacggcctgcgcagggtgctggatgagctgaccctggccaggaccgacctggagatgcagatcgaaggcctgaaggaagagctggcctacctgaagaagaaccatgaggaggaaatcagtacgctgaggggccaagtg