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骨组织工程技术为外伤、骨肿瘤、骨病等造成的骨缺损修复提供了一种新的治疗途径。具有多孔三维结构组织工程支架的开发是组织工程骨构建中的重要研究内容。理想的骨组织工程支架应该能模拟骨组织的形态、结构和功能。壳聚糖（chitosan，CS）、羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）在组织工程骨构建中是较理想的材料。HA是骨组织的成分，纳米HA（nano-HA）除了具有传统HA的特性外，理化和生物学性能也很理想。为了结合CS和HA两种材料的优点开发骨组织工程支架，常把这两种材料复合得到性能更好的骨组织工程支架材料。传统的制备方法是将nano-HA粉体与CS溶液共混得到骨组织工程支架，但是nano-HA存在易聚集、分散困难等缺点。虽然采用原位复合的方法可以制备出nano-HA分散均匀的nano-HA／CS体系，但是得到骨组织工程支架材料没有细胞迁移、生长所必需的多孔结构。本研究通过将原位复合和冷冻干燥相结合的方法制备了多孔的nano-HA／CS（CS粘均分子量5.95×105，脱乙酰度90.75％）骨组织工程复合支架，在评价其理化和生物学性能的基础上，用此复合支架在体外构建组织工程化骨。主要研究内容：1．采用原位复合．冷冻干燥法制备nano-HA／CS骨组织工程复合支架，通过扫描电镜、透射电镜、X线衍射和傅立叶红外光谱分析支架的微观形貌及材料的组成。2．研究不同HA／CS固体含量、比例；原位复合反应中不同NaOH液浓度；不同预冷冻温度对支架物理化学性质的影响。3．通过nano-HA／CS支架在模拟体液的浸泡实验，初步在体外评价其生物活性，检测类骨磷灰石在支架上的形成状态。4．分离初生Wistar大鼠的成骨细胞，进行鉴定并探讨大鼠成骨细胞在体外增殖、分化过程；传代培养体外扩增种子细胞，为构建组织工程骨建立基础。5．取传代培养至第3代成骨细胞与nano-HA／CS支架复合培养，在体外构建组织工程化骨；测定成骨细胞在支架上的黏附率并与细胞在纯CS支架上的黏附率作比较；检测成骨细胞在不同支架上的增殖曲线并通过组织化学染色、扫描电镜观察细胞形态。实验结果表明：采用原位复合-冷冻干燥法制备的nano-HA／CS骨组织工程复合支架具有多孔结构，孔径在100μm-500μm左右，大多数孔径在300μm-400μm间。复合支架具有很高的孔隙率，并且随CS和HA含量的增加，复合支架孔隙率明显降低，密度升高，压力强度增高，nano-HA／CS复合支架（CS 3％，CS-HA 3／1）压力强度可以达到1.41MPa。通过改变预冷冻温度，可以控制复合支架的孔径和孔隙率，预冷冻温度越低，支架的孔径越小，孔隙率越低。扫描电镜和透射电镜观察显示，合成的HA晶体，晶粒大小为纳米级，晶粒在复合支架孔壁上均匀、连续分布如“铺路石”样。X线衍射和红外分析表明，合成的HA是含CO32-弱结晶纳米晶体与骨磷灰石类似。复合支架在模拟体液中，CS可以逐渐降解，nano-HA溶解，并且可以促进类骨磷灰石沉积。从初生Wistar大鼠颅骨提取的成骨细胞细胞在体外培养增殖迅速、性状稳定。把提取的种子细胞种植在nano-HA／CS复合支架和纯CS支架上培养2、4、6、8小时，在复合支架上的黏附率明显高于纯CS支架。成骨细胞能在支架上黏附、增殖，分泌含Ⅰ型胶原的细胞外基质，并使其矿化。以上结果表明，采用原位复合与冷冻干燥法结合制备的nano-HA／CS复合支架具有良好的理化性质和细胞相容性，可望应用于组织工程骨的构建。