研究背景目前自体游离毛发移植术已成为临床治疗毛发缺陨特别是雄激素性秃发最常用的手术方法，但存在许多问题，如供区不足、供区瘢痕、移植密度低、移植成活率低，明显影响手术效果，毛囊组织工程的研究成为了解决这些问题的关键。毛囊是由上皮成分(包括毛母质、内外根鞘)和真皮成分(包括毛乳头、结缔组织鞘)组成的，其中毛乳头细胞是构成毛乳头的主要间质细胞，它们是一簇特化的成纤维细胞。所有的毛乳头细胞在外观上都呈成纤维细胞样，而且在含有小牛血清的培养基中培养的毛乳头细胞有着聚集性生长的特性。随着毛囊的周期性循环，毛乳头的形态也发生着周期性的改变。它在毛囊的生长发育形成及周期调控中起着重要的作用。因此建立毛乳头细胞体外培养模型，对于洋尽地了解毛乳头细胞体外培养生长特点，以及如何诱导毛囊的发生，具有重要的意义。毛囊中的上皮成分是毛发纤维产生的基础，对于毛囊组织工程的构建是必不可少的种子细胞，但目前对于这两类细胞的分离方法也只适用于实验室的少量制备，不适合于组织工程对细胞分离的大规模高效快速的要求。另一方面大鼠触须毛乳头细胞和毛囊上皮细胞的分离培养更便于复杂的实验设计，特别是对基因标记和基因表达的研究具有重要意义，但目前只有显微解剖的方法，操作繁杂、劳动量大、毛乳头贴壁困难、细胞迁出慢、易污染，不便于实验开展。研究目的1．建立适用于组织工程的大规模、高效、快速分离培养人头皮毛乳头细胞和毛囊上皮细胞的方法2．改进大鼠触须毛乳头细胞和毛囊上皮细胞的分离方法3．探索有效的毛囊重建的方法。研究方法1．人头皮毛乳头细胞的分离、培养和签定。采用消化过滤法和显微解剖法分离人头皮毛乳头细胞。将处理好的头皮标本沿真皮与皮下组织交界处剪开，将含有毛囊中下部的皮下组织剪碎，在37℃缓慢搅拌的条件下加入0.2％胶原酶Ⅰ消化4小时，悬液经400目筛网过滤，收集被筛网截留的毛乳头，PBS液离心洗涤三次。解剖法参照文献中的操作进行。使用含15％FCS的DMEM培养基进行毛乳头细胞的培养，观察其在体外培养的形态学和生物学特点，比较两种分离方法的的贴壁率，并进行α-SMA免疫组化染色。2．人头皮毛囊上皮细胞的分离、培养和鉴定。采用分步消化法获得人毛囊上皮细胞，剪去头皮外毛发，置2.5g／L的洗必泰溶液中浸泡消毒10-15min，然后在无菌的PBS中洗涤两遍。用剪刀在头皮内侧将含毛囊的真皮和皮下脂肪剪下，剪碎后在37℃缓慢搅拌(100rpm)的条件下加入0.2％胶原酶Ⅰ消化4小时，悬液静置，使含有毛囊上皮鞘的毛干沉淀，经800目筛网过滤洗剂三遍，然后把收集到的毛干用0.1％的胰酶在25℃静置消化10分钟，加入含10％(体积比)胎牛血清的K-SFM培养基，中止消化后吹打，混悬液经800目筛网过滤，滤液离心3次(800rmp，5分钟)，收集细胞，观察其在K-SFM培养基上体外培养的形态学和生物学特点，并进行角蛋白19免疫组化染色。3．大鼠触须毛乳头细胞分离、培养。采用全毛囊消化法和显微解剖法分离触须毛乳头细胞，观察其在体外培养的形态学和生物学特点。大鼠麻醉后修剪颊侧被毛，常规消毒后剪去全层皮肤，暴露其下方的触须毛囊，然后用镊子将其完整拔出，置离心管中，在37℃缓慢搅拌的条件下加入0.2％胶原酶Ⅰ消化3小时，间断吹打使毛乳头游离，静置使毛干沉入管底，吸出上清，经400目筛网过滤后收集截留的毛乳头。显微解剖法参照文献中的操作进行。4．大鼠触须毛囊上皮细胞的分离、培养。采用全毛囊两步消化法分离触须毛囊上皮细胞，大鼠麻醉后修剪颊侧被毛，常规消毒后剪去全层皮肤，暴露其下方的毛囊，然后用镊子将其完整拔出，置离心管中，在37℃缓慢搅拌(100rpm)的条件下加入0.2％胶原酶Ⅰ消化3小时，静置后毛干经800目筛网过滤，然后用PBS洗涤被筛网截留的含毛囊上皮鞘的毛干，把收集到的毛干用0.1％的胰酶在25℃静置消化10分钟，加入含10％(体积比)胎牛血清的K-SFM培养基，中止消化后吹打，混悬液经800目筛网过滤，滤液离心3次(800rmp，5分钟)，收集细胞，观察其在K-SFM培养基上体外培养的形态学和生物学特点。5．毛囊重建的方法。裸鼠皮下注射分离的毛囊复合组织群，14d后进行组织切片。研究结果1．采用消化过滤法成功分离到人毛乳头细胞，通过体外原代培养可以快速、高效扩增。贴壁率高，可达到96％，表现出明显的凝集性生长，α-SMA免疫组化染色呈现阳性。2．采用分步酶消化法成功分离到人头皮毛囊上皮细胞，可在K-SFM培养基中生长良好，呈铺路石样。角蛋白19免疫组化染色阳性。3．采用全毛囊消化法成功分离到大鼠触须毛乳头细胞，细胞贴壁率高，可达95％，表现出明显的凝集性生长。4．采用全毛囊两步酶消化法成功分离到大鼠触须毛囊上皮细胞，可在K-SFM培养基中生长良好，呈铺路石样。5．裸鼠皮下注射分离的毛囊复合组织群14d后组织切片可见有新生毛囊形成。研究结论1．消化过滤法和分步消化法可实现对人头皮毛乳头细胞和毛囊上皮细胞的大规模、高效、快速分离，适合于组织工程的应用。与显微解剖法相比，消化过滤法获取的毛乳头细胞贴壁快，贴壁率高。2．全毛囊消化法是分离大鼠触须毛乳头细胞和毛囊上皮细胞的有效方法。克服了显微解剖法获取的毛乳头不易贴壁、毛乳头细胞迁出困难、生长缓慢的缺点。3．毛囊中单个细胞构成的细胞群可在一定条件下重新形成毛囊结构。