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本研究以自然界腐烂的五倍子为原料,在以单宁为唯一碳源的培养基中对腐烂五倍子中的微生物进行筛选,并以菌落及水解圈的大小作为初筛原则,从中筛选出20株生产单宁酶的纯种菌株。摇瓶复筛结果表明,菌株T3的产单宁酶活力最高,达到23 U/mL。通过对菌落形态观察和水浸片的观察,初步鉴定目标菌株T3为曲霉。对T3的生长曲线,产酶曲线,没食子酸积累曲线的研究表明,T3菌株在摇瓶培养的第3天,生长己进入稳定期,其产单宁酶的酶活力最高,而此时培养基中的没食子酸含量已经出现了下降,说明T3菌种在生长的过程中,可以以没食子酸做为生长用的碳源。
对菌株进行60Co辐照诱变,研究了辐照剂量与致死率的关系,当辐照剂量在100Gy和300 Gy的时候,致死率较低,为14.51%和25.78%;当辐照剂量上升到500 Gy的时候,此时致死率迅速上升,达到88.99%;当辐照剂量继续上升时,在700 Gy与900 Gy下,致死率都>99%。通过对含溴酚蓝的初筛平板中菌落变色率的研究发现,在从100 Gy到900 Gy的五个辐照剂量下,均出现了比对照平扳变色更早的菌落,因此证明在五个辐照剂量的诱变下,均能产生正突变菌落,其中,500 Gy的变色菌落最多,因此500 Gy辐照剂量下,正突变率最大,为最佳辐照剂量。通过溴酚蓝平板初筛,选择变色最早,菌落直径最大的单菌落进行摇瓶发酵复筛,得到一株编号T3-5-1的曲霉,其产单宁酶活力达到47.69 U/mL,比对照菌株T3的21.47 U/mL提高了222.17%,对其进行传代稳定性研究表明,其传代稳定,未发现菌种退化现象;对其菌落形态和水浸片观察,也未发现其与出发菌株T3产生形态上的差异。
对T3-5-1的最优培养条件进行单因素及正交研究表明,以B-环糊精为碳源、蛋白胨为氮源、培养基初始pH为5.5、单宁酸浓度为3.5%、接种量为5%,摇瓶培养转速120/min,250 mL三角锥瓶中装液50 mL培养基,培养温度为30℃为曲霉T3-5-1的最佳产单宁酶条件。在此条件下,T3-5-1产单宁酶活力达到202.16 U/mL,比优化前提高约4倍。
对T3-5-1发酵所产的单宁酶进行分离纯化,研究发现,传统的硫酸铵沉淀方法并不适用于单宁酶的分离纯化,而直接使用截留分子量12000的透析膜就能达到较好的初步纯化效果,对透析样品进行G-100葡聚糖凝胶层析,得到纯度较高的单宁酶,通过与单宁酶A(sigma)及单宁酶B比较发现,其分子量基本相同。而T3-5-1产单宁酶的比活力最高,达到5304.53 U/mg,单宁酶A为1788.15 U/mg,单宁酶B为935.12U/mgo
对单宁酶在反胶束溶液中的催化反应研究表明,在AOT异辛烷反胶束体系中,单宁酶能催化没食子酸与丙醇的酯化反应,生成没食子酸丙酯。在催化没食子酸与白藜芦醇,二氢杨梅素等含酚羟基类化合物的酯化反应的研究中发现,使用AOT异辛烷反胶束体系,通过换用乙酸乙酯,丙酮,四氢呋喃等不同的助溶剂,发现并没有酯化产物产生。由于酯化反应是一个脱水的反应,因此在添加脱水剂X后,没食子酸与酚羟基化合物的酯化反应得以进行,没食子酸在添加脱水剂X后的AOT异辛烷反胶束体系中,会发生自身聚合反应,生成化合物A与化合物B,其中化合物A通过质谱鉴定其分子量为680,为4个没食子酸的聚合物,而在没食子酸与二氢杨梅素的反应中,也发现有新的化合物C生成。