目的:Nanos是RNA结合蛋白,在它的羧基端具有两个在进化上高度保守的锌指结构域锌指结构域,常常作为翻译抑制而发挥作用。Nanos基因最早是在模式生物果蝇的体内发现的,它与Pumilio基因一起发挥作用,参与果蝇体轴的正常发育,多年的研究表明Nanos对于生殖细胞的分化发育的至关重要的,它可以调控生殖细胞的更新及向生殖腺的迁徙,并且可以抑制生殖细胞的早熟和倾向体细胞的分化。在本课题研究中,通过原位杂交和RAN干扰这两个实验方法,初步确定了Nanos在日本血吸虫的表达定位及功能。方法:本研究首先利用BLAST软件在日本血吸虫Nanos基因的开放阅读框中选取一段特异性的序列(第416-657碱基)以制备原位杂交所需要的探针。针对这段特异性的序列设计引物并送至公司合成,利用PCR技术扩增此段序列,然后将这段序列与PMD18-T载体连接构建Nanos-PMD18-T质粒,转化感受态XL1-BLUE大肠杆菌,用氨苄青霉素(AMP)筛选后挑取单个菌落,提取质粒,经过EcoRI和HindIII双酶切鉴定后送至公司测序。经公司测序正确后,EcoRI和HindIII双酶切Nanos-PMD18-T质粒,并将酶切产物与pspt19载体连接构建Nanos-pspt19质粒,转化感受态细胞、挑菌、提质粒,经过EcoRI和HindIII双酶切鉴定后送至公司测序。测序正确后,HindIII或EcoRI单酶切Nanos-pspt19质粒,分别得到制备正义链探针或反义链探针的模板,并通过DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7)试剂盒进行体外转录,从而得到正义链探针或反义链探针。制备成功的探针可放置在-80℃保存、备用,按终浓度为5ng/ml用于原位杂交。冰上分离18天、24天和42天雌雄虫,经过固定、蛋白酶K处理、杂交、显色等步骤,使用正置荧光显微镜拍照。本课题运用RAN干扰的方法鉴定Nanos蛋白的功能。首先根据软件设计针对Nanos基因的5段不同的siRNA序列,分别命名为N1、N2、N3、N4和N5并送至上海吉玛公司合成。6-8周昆明鼠感染60只左右的尾蚴,24天后杀鼠取虫,刚取出的血吸虫经过无菌pbs和1640培养基洗涤后,将血吸虫放入12孔板内用2ml1640培养基+10%血清+三抗培养48小时。在培养的这72小时的过程中,0小时和24小时分别用permute转染试剂将终浓度为200nm的sirna转染日本血吸虫。培养72小时后,分别提取各组日本血吸虫的总rna、逆转录cdna,然后通过荧光定量pcr技术确定之前设计的5段sirna中基因沉默效果最好的一段,最后用此段sirna构建能够表达shrna的rnai质粒并包装逆转录病毒,将带有目的rnai质粒的逆转录病毒与18天日本血吸虫共培养两周左右,研究干扰后日本血吸虫基因水平、蛋白水平及形态的改变。结果:双酶切产物琼脂糖凝胶电泳及测序结果均显示nanos-pmd18-t重组质粒和nanos-pspt19重组质粒构建成功。利用hindiii或ecori单酶切nanos-pspt19质粒得到nanos基因正义链探针或反义链探针的模板,成功体外转录nanos基因正义链探针或反义链探针,并以此用于18天、24天和42天血吸虫的原位杂交。原位杂交结果显示18天、24天和42天血吸虫雌虫的反义链探针组有明显蓝色阳性信号,而雄虫未见任何阳性信号。将终浓度为200nm的小干扰rna片段n1、n2、n3、n4及n5分别与24天日本血吸虫共培养72小时后提取各组日本血吸虫的总rna、逆转录cdna,通过荧光定量pcr技术确定n3对nanos基因表达的消减效果最明显。逆转录病毒感染18天日本血吸虫,实验组为可以表达nanos基因shrna的逆转录病毒,对照组为表达乱序的不针对日本血吸虫任何基因的shrna的逆转录病毒。病毒感染18天日本血吸虫后体外培养14天,分别提取未处理组、对照组及实验组虫体总rna,通过q-pcr实验显示对照组nanos基因水平表达不降低,实验组nanos基因水平表达下降65%左右。虫卵计数结果显示实验组较对照组减卵率达28%,实验组虫卵明显变小并且成熟度明显降低。激光共聚焦显微镜下观察干扰后雌雄虫的形态变化,其中雌虫的卵巢周围出现大的空泡,卵巢内细胞排列疏松,形态异常;而雄虫睾丸未见明显的形态改变。结论:本实验通过18天、24天和42天发育阶段的日本血吸虫整虫原位杂交结果显示nanos基因高表达于24天和42雌虫卵巢和卵黄腺,18天雌虫高表达于卵巢,而雄虫未观察到阳性信号。RNAi实验结果显示Nanos基因水平表达下降65%左右,虫卵计数结果显示减卵率达28%,虫卵明显变小并且成熟度明显降低。激光共聚焦显微镜下观察显示雌虫的卵巢周围出现大的空泡,卵巢内细胞排列疏松,形态异常;而雄虫睾丸未见明显的形态改变。