血红蛋白(Hb)和肌红蛋白(Mb)是globin家族中研究最透彻的两种蛋白,它们的功能主要与氧运输和氧存储有关。近十几年随着测序技术和基因组研究的发展,在脊椎动物中又发现了多种globin家族的新成员,截止到目前这些新成员包括neuroglobin(Ngb)、cytoglobin(Cygb)、androglobin(Adgb)、globin E(GbE)、globin X(GbX)和globin Y(GbY)。研究表明,这些新发现的globin家族蛋白通常具有与Hb和Mb相似的生理功能,如氧运输、ROS防御和NO代谢等,因此它们可能在动物高原低氧适应中发挥重要作用。本论文的主要目的是研究沙蜥属蜥蜴globin基因家族成员在高海拔适应中的潜在机制。研究思路和技术路线为:1)通过比较基因组分析的方法确定有鳞类动物基因组中globin基因家族的保留现状;2)通过比较转录组分析的方法研究globin基因家族成员在蜥蜴类动物中的表达谱、组织特异性表达和海拔依赖的差异表达模式;3)通过生理生化、分子进化和蛋白结构分析探讨高海拔沙蜥属蜥蜴globin家族成员的适应性进化机制。主要研究结果如下:基因组分析表明有鳞类动物保留了除GbE外所有脊椎动物globin基因家族成员包括两个拷贝的α(αA和αD)和β(β1和β2)、单拷贝的Mb、Ngb、Cygb、GbY、GbX和Adgb。我们研究的所有蜥蜴类动物都表达αA、αD、β1、β2、Mb、Ngb和Cygb,但GbY、GbX和Adgb仅在部分蜥蜴中表达。四足类动物α基因进化关系研究表明,αE、αD和αA基因起源于四足类动物干谱系的两次单基因复制。αA和αE起源于一个原α基因的第一次基因串联复制,αD基因起源于四足类动物干谱系中αA基因的一次串联复制。随后αD与αE基因间的转换使得爬行动物和鸟类成体表达的αD型血红蛋白亚型具有较αA型高的氧亲和力,可以有效提高肺部氧气的获取效率,因而在肺部结构进化相对不完善(具有较哺乳类简单的肺结构)的动物类群中具有重要的生理意义。生活在青藏高原上的红尾沙蜥是世界上海拔分布最高的蜥蜴,与低海拔分布的荒漠沙蜥相比,红尾沙蜥的血红蛋白(Hb)涉及多个方面的改变。首先,红尾沙蜥Hb基因(αA、αD和β1差异显著)的高表达使得其总血红蛋白浓度[Hb]升高,升高的[Hb]可以有效增加动脉氧容量从而提高低氧环境下血液氧运输的效率。其次,沙蜥属蜥蜴Hb表现出较高的多态性,在这点上与鸟类和龟鳖类相似,包括4种Hb亚型HbAA1、HbAA2、Hb AD1和HbAD2(按预测的氧亲和力从低到高排列)。与荒漠沙蜥相比,红尾沙蜥αD/αA(高氧亲和力与低氧亲和力Hb亚型的比值)显著升高,这将导致红尾沙蜥全血氧亲和力相应升高。高氧亲和力Hb亚型比例的升高有利于红尾沙蜥肺部氧气的装载过程,同时低氧亲和力的HbAA1和HbAA2的存在可以保证在需氧组织处氧气的卸载过程不受影响。最后,与荒漠沙蜥HbAA2(αAβ2)亚型相比,红尾沙蜥β2亚基21位氨基酸Gly到Ser的突变在该区域增加了一个侧链羟基,该羟基可以通过氢键与61位和65位Lys相互作用,从而增大了63位远端组氨酸与血红素Fe2+之间的距离。这一距离的增加使得Hb与氧气结合过程的空间位阻减小,从而有利于其与氧结合和解离。因此红尾沙蜥HbAA2的独特结构既有利于肺部氧气装载的过程,又有利于血液在流经氧组织时氧气的卸载过程。作者认为红尾沙蜥这两种血液氧亲和力的调节方式是其适应高原低氧环境重要机制,该机制在其它动物中尚未见报道。急性低氧条件下,红尾沙蜥和荒漠沙蜥并没有出现类似于哺乳类和鸟类的低氧诱导的呼吸加速反应,说明沙蜥属蜥蜴呼吸调节系统对急性低氧条件并不敏感。两种沙蜥呼吸系统钝化的低氧敏感性可能是沙蜥属蜥蜴的共同表型与栖息地的海拔高度没有直接关系。种间比较结果显示,红尾沙蜥在常氧和低氧条件下呼吸频率显著大于低海拔的荒漠沙蜥,而心率却显著低于荒漠沙蜥。两种沙蜥呼吸频率和心率很可能与特定环境下的长期进化有关,可能涉及外周化学感受器对氧浓度变化的脱敏性调节,具体机制还需进一步研究。红尾沙蜥较高的呼吸频率并没有造成呼吸性碱中毒(两种沙蜥血液pH无差异),因此我们认为红尾沙蜥较高的呼吸频率是在高原环境中长期进化出的适应性特征。与辛英等(2015年)的研究结果相符,转录组分析结果也证明了红尾沙蜥心脏和骨骼肌中Mb表达显著高于荒漠沙蜥。此外,我们在高海拔红尾沙蜥的脑和肝脏中也检测到Mb基因的表达,而在低海拔的荒漠沙蜥这两个组织中不表达Mb。但由于表达量相对较低,作者认为Mb在沙蜥脑和肝脏中的功能可能不涉及氧气的运输。在代谢活跃(氧分压较低)的脑和肝脏组织中的Mb主要为去氧合态,有文献报道这种状态的Mb具有亚硝酸还原酶活性,能促进NO的生成,因此我们推测,红尾沙蜥脑和肝脏中表达的Mb可能主要参与NO介导的血流量调节。尽管目前globin家族新成员的生理功能尚不明确,但本研究的结果表明Ngb和Cygb可能在沙蜥属蜥蜴的高原适应中起到重要作用。高海拔沙蜥Ngb的11、33、37和131位氨基酸突变显著提高了该蛋白的亲水性,有利于其从线粒体表面到细胞质的转移。因此我们推测高海拔沙蜥属蜥蜴很可能在胞浆中积累较高浓度Ngb,行使其在胞浆中氧运输、NO解毒和ROS防御等生理功能。与荒漠沙蜥相比红尾沙蜥Cygb-X1在肝脏中的表达显著上调。肝脏是机体代谢最活跃的器官之一,低氧会抑制肝脏的有氧代谢过程。Cygb-X1在高海拔红尾沙蜥肝脏中的表达上调很可能有利于缓解肝脏的低氧压力。蛋白结构分析表明,高海拔的贵德沙蜥与荒漠沙蜥相比194位氨基酸的突变可能使得Cygb-X1二聚体结构的稳定性降低,从而有利于其氧和的解聚过程,提高其氧亲和力以及组织氧供应效率。以上结果表明Cygb-X1在不同沙蜥物种可能进化出不同的高原适应机制。总之,沙蜥属蜥蜴globin家族成员(除GbY外)呈现出多样化的高原适应特征,本文的这些研究成果填补了globin家族新成员的研究以及该蛋白家族在沙蜥属蜥蜴高原适应机制中的作用的空白,有助于进一步丰富和完善动物高原低氧适应生理生化机制的理论体系,并为高原医学的研究和发展提供参考。