雌核发育二倍体鲫鲤生殖细胞减数分裂特征研究

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以红鲫(Carassius auratus red var.,2n=100)为母本,鲤(Cyprinus carrpio L.,2n=100)为父本进行远缘杂交,经过多代培育获得异源四倍体鲫鲤。对其产生的二倍体卵子进行雌核发育研究,建立了雌核发育二倍体鲫鲤克隆体系。雌核发育二倍体鲫鲤是一种全雌异源二倍体鱼,两年性成熟,能稳定产生二倍体卵子。本论文以雌核发育二倍体鲫鲤为实验材料,通过对其生殖细胞的减数分裂过程进行观察,探究其不减数配子形成的可能机制,具体研究结果如下:1)对5月龄雌核发育二倍体鲫鲤卵巢组织进行超微结构观察,发现生殖细胞中存在双核现象;对同时期的性腺进行体外培养,并通过活细胞工作站观察细胞生长特征,发现生殖细胞间发生细胞融合,形成大量双核细胞。2)通过对雌核发育二倍体鲫鲤卵巢生殖细胞染色体制片,获得一系列减数分裂不同阶段的染色体分裂相,包括细线期、偶线期、粗线期和双线期。说明在一定时期时生殖细胞能正常进行减数分裂。3)以红鲫着丝粒标记因子263 bp重复序列和染色体臂间标记因子340 bp 5S r DNA为探针对雌核发育二倍体鲫鲤不同发育时期的生殖细胞进行染色体荧光原位杂交(FISH)研究,发现5月龄生殖细胞染色体荧光标记信号分散,没有成对的荧光信号。而10月龄生殖细胞染色体存在成对的荧光信号。同时对10月龄该卵巢组织进行超微结构观察,发现其生殖细胞中染色体具有明显的联会复合体结构。通过对联会复合体组成蛋白SCP3进行染色体免疫荧光检测,该时期生殖细胞染色体中具有完整的联会复合体结构,说明生殖细胞在融合之后通过染色体加倍形成能够配对的同源染色体,随即发生联会。4)对不同发育时期卵巢中的联会蛋白MLH1和重组蛋白MSH5进行蛋白印迹检测,结果发现在早期5月龄的性腺未能检测到这两种蛋白的形成,而在融合后的生殖细胞中检测到MLH1和MSH5蛋白的表达。5)通过qRT-PCR对雌核发育二倍体鲫鲤不同时期卵巢以及不同组织中的有丝分裂相关基因cyclin E1、cyclin B和cdc2的表达水平进行检测,结果表明:有丝分裂相关基因在雌核发育二倍体鲫鲤Ⅰ期卵巢中表达水平明显高于其它组织,同时也显著高于Ⅱ期卵巢,说明早期卵巢中生殖细胞有丝分裂旺盛,卵原细胞增殖正常。进一步对雌核发育二倍体鲫鲤不同发育时期卵巢中的减数分裂相关基因spo11、atm、atr、rad50、dmc1和scp3表达水平进行检测,发现在Ⅰ期卵巢和Ⅱ期卵巢中皆有表达,且Ⅰ期卵巢的表达水平高于Ⅱ期卵巢,说明Ⅰ期卵巢是进行早期减数分裂的主要阶段。6)利用高通量测序技术对二倍体红鲫和雌核发育二倍体鲫鲤早期卵巢进行转录组差异分析,同时也对雌核发育二倍体鲫鲤卵巢不同发育时期的m RNAs的表达趋势进行研究。通过对差异表达基因的筛选与功能富集分析,预测与不减数二倍体卵子形成相关的关键调控元件。转录组测序结果显示,以红鲫为对照,在雌核发育二倍体鲫鲤早期性腺中获得6631个差异表达基因(2093个上调和4538个下调),对其进行GO和KEGG富集分析,发现差异表达基因显著富集于c GMP-PKG信号通路、卵母细胞减数分裂和孕酮介导的卵母细胞成熟等通路。进一步对雌核发育二倍体鲫鲤不同时期性腺转录本进行趋势分析,共获得20个趋势模块(Profiles),其中Profile 19(持续上调)趋势基因数最多,其次是Profile 5(下调-上调-下调)和Profile 16(上调-不变-下调),对这三个Profiles进行KO富集分析,发现Profile19中的基因主要与新陈代谢相关,而Profile 5和Profile 16中的基因与PI3K-Akt信号通路、蛋白消化和吸收、黏着斑、细胞外基质受体相互作用有关。综上所述,通过对雌核发育二倍体鲫鲤生殖细胞不同发育时期染色体行为及其相关基因表达特征进行研究,初步阐明这种异源二倍体鱼产生不减数配子的生物学基础。该研究不仅在繁殖生物学中具有重要意义,而且为多倍体育种提供理论依据。
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