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背景:葡萄糖转运体9(glucose transporter 9,GLUT9)是存在于近曲小管上皮细胞基侧膜上的一种葡萄糖易化转运体,是一种新型的高容量、低亲和力的尿酸转运体,对维持体内尿酸水平起着重要作用。人体内的GLUT9分为GLUT9a和GLUT9 b两种亚型,以相同动力学转运尿酸。抑制GLUT9将大大减少尿酸的重吸收而促进尿酸排泄是促尿酸排泄的重要靶点,与其他尿酸相关转运体共同维持着体内尿酸的动态平衡。目的:模建hGLUT9a的三维结构模型,通过分子对接技术寻找有效的关键位点与抑制药物;对预测的活性位点进行定点突变,构建hGLUT9b突变体重组质粒;构建稳定表达GLUT9的细胞模型,建立抑制剂的筛选模型,为临床筛选有效的促尿酸排泄药物提供实验基础;采用脂质体瞬时转染方式建立能表达GLUT9及其突变体的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary cell,CHO-K1)细胞模型验证活性位点并筛选潜在的活性抑制剂;利用高尿酸血症小鼠模型研究潜在化合物的降尿酸作用。方法:本项目利用同源模建构建并优化了尿酸转运体hGLUT9a的构象,采用拓扑学结构特征和ERRAT函数与拉氏图的方法对所构建的结构进行可靠性分析;采用分子对接技术和同源家族序列比对的方法探索尿酸与hGLUT9a的结合模式并分析一些正在研发阶段的药物与受体的结合模式,从而寻找hGLUT9a可能的关键活性位点;构建筛选出来的关键位点的相应hGLUT9b突变体重组质粒;构建含hGLUT9a基因的慢病毒质粒并感染CHO-K1细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定表达 hGLUT9a 的细胞株。通过 RT-qPCR 及 Western-blot 检测 hGLUT9a mRNA 与蛋白的表达情况鉴定hGLUT9a稳转细胞株。采用脂质体瞬时转染GLUT9至CHO-K1细胞,并利用膜片钳技术筛选有效的GLUT9抑制剂以及验证几个关键位点L303A、F397A、W430A、N433A(对于hGLUT9b)对尿酸转运的影响;通过建立氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠模型,评价在细胞实验中活性较好的化合物的体内活性。结果:成功模建hGLUT9a的三维模型,其ERRAT与procheck评分分别94.9495与92.7。小分子化合物与模型进行分子对接,并预测其与hGLUT9a模拟口袋的结合能力强弱依次为3170-M>3170>丙磺舒>苯溴马隆>HS062#>芹菜素;并预测关键性位点 L332、F426、W459、N462(对于 hGLUT9a)或 L303A、F397A、W430A、N433A(对于hGLUT9b),成功将其突变构建重组质粒。成功构建稳转株CHO-hGLUT9a,目的基因mRNA的表达量是对照株的103万倍。膜片钳验证转染GLUT9基因的CHO细胞转运尿酸能力明显增强,其Km值为137.7±37.2μM。电生理结果显示 3170(100 μM)、3170-M((100 μM))、HS062#(100 μM)、芹菜素(100 μM)、苯溴马隆(100 μM)与丙磺舒(1 mM)对mGLUT9的抑制率分别为 13.7±2.4%、88.7±2.8%、55.7±3.6%、9.5±0.5%,92.1±1.4%,80.9±7.1%。突变体L303A、W430A、N433A均能降低hGLUT9b转运尿酸的作用。HS062#与3170-M明显降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸小鼠血尿酸水平(p<0.01),其中HS062#能明显升高其尿液尿酸水平(p<0.001)。结论:本实验成功模建出hGLUT9a的三维结构模型,预测不同化合物与其结合能力,并预测相关活性位点。本文成功构建了能用于筛选影响hGLUT9的关键活性位点及其有效抑制剂的电生理细胞模型。此外,利用慢病毒感染的方法构建了能稳定表达hGLUT9的细胞系,可用于筛选hGLUT9有效抑制剂,为临床寻找有效的促尿酸排泄药物提供实验基础。动物实验结果表明,受试化合物HS062#与3170-M能有效地降低高尿酸血症小鼠的血尿酸水平,HS062#与3170-M有成为有效的降尿酸化合物的潜力。