1.目的运用文献综述、理论探讨、实验研究的研究方法,探讨并分析中医理论中肺“主气,司呼吸”与“通调水道”间的关系及临床运用,并阐释其现代医学分子生物学相关机制。2.方法2.1文献综述查阅水通道蛋白AQP1、AQP2的中外相关文献,了解并综述基本研究情况及相关分子生物学研究动态,关注其在中医理论研究中的相关应用。2.2理论探讨人体湿邪的产生多与气化不利有关,气化功能失常是湿热为病的重要原因。本文梳理《黄帝内经》《伤寒杂病论》等中医经典理论及后世医家相关论述,追溯宣降肺气药物治湿热病渊源;从分消走泄法的理论依据及其用药规律,探讨宣降肺气药物在湿热病治疗中的应用。旨在拓宽思路,指导临床实践。2.3实验研究短时间内改变肺的呼吸功能,观察监测并尿量变化,分析两者之间相关性并从分子生物学角度探讨阐释其机制。2月龄雄性清洁级健康新西兰家兔,随机分为2组,随机将家兔分为对照组和模型组,每组各8只。家兔称重后,从耳缘静脉进行麻醉,以软管留置针按5ml/kg标准缓慢推注20%氨基甲酸乙酯溶液。确认家兔完全麻醉后,在耳缘固定软管留置针,并注射1ml的1%肝素钠溶液封管。家兔在手术台仰卧固定并备皮,待家兔完全麻醉后切开家兔颈部皮肤,暴露气管,分离并标记气管两侧迷走神经、交感神经和减压神经以备用,进行气管插管,颈动脉插管、尿道插管并固定;同时将输液管连接耳缘静脉处软管留置针,连续静脉滴注(30滴/分钟)5%葡萄糖与0.9%氯化钠的混合溶液,以防止实验过程中因体液消耗影响尿量,并记录静脉滴注时间。打开Medlab BL-420生物信号采集系统,确认静脉滴注(30滴/分钟)含5%葡萄糖与0.9%氯化钠的混合溶液至少已30min后,开始实验。整个实验过程,保持含5%葡萄糖与0.9%氯化钠的混合溶液静脉滴注(30滴/分钟),实验过程分以下4个阶段进行:第一阶段(平静呼吸):两组实验动物保持平静呼吸状态,用尿滴换能器监测实验动物此状态下10min内的尿滴数的情况,并记录。第二阶段(扩肺干预):对照组家兔保持平静呼吸,不作干预。模型组家兔气管连接呼吸机进行干预10min。监测两组家兔不同状态下10min内尿滴数情况第三阶段(平静呼吸):拔出模型组家兔气管中呼吸机连接装置。记录两组家兔平静呼吸10min内尿滴数的情况。第四阶段(剪断神经,扩肺干预):剪断两组家兔颈部双侧已分离出的神经后,对照组家兔保持平静呼吸,不作干预。模型组家兔气管连接呼吸机进行干预10min。记录两组家兔10min内尿滴数。第五阶段:模型组家兔拔下呼吸机,停止扩肺干预,与对照组家兔同样平静呼吸十分钟,记录10min内的尿滴数。尿量监测结束后,迅速取下家兔的右肺组织、左上肾组织置4%多聚甲醛溶液中固定,用于HE染色常规形态学观察和免疫组化方法检测AQP1、AQP2蛋白水平;迅速取下左下肾组织并置冻存管,放置-80℃冰箱冷藏保存,用于实时荧光定量PCR方法检测AQP1mRNA、AQP2mRNA水平。3结果3.1文献综述及理论探讨宣降肺气药物治疗湿热病的机理渊源于《内经》、《伤寒杂病论》,历代医家在继承中医经典理论的基础上结合临床不断发挥,往往将从肺论治湿热病作为湿热病的重要治法。宣降肺气药物的合理运用,在现代疾病谱湿热证逐年增多的今天,可以丰富湿热病的治疗内容,启迪并拓展我们的临床用药思路。水通道蛋白的分子结构以AQP1研究的最清楚。AQP1在哺乳动物中的蛋白氨基酸序列差别较小。以AQP1结构为模型,目前已对水通道蛋白结构进行了大量研究。近曲小管的水渗透性主要由水通道蛋白AQP1介导,并且为等渗液体的有效重吸收所需要。直小血管由AQP1介导的水的转运能维持逆流交换系统功能。AQP2的调节分为短期调节和长期调节,前者主要是对包含AQP2的囊泡向管腔细胞膜转运过程的调节,即对AQP2穿梭机制的调节,后者主要是对AQP2基因和蛋白表达的调节。AQP2是目前所知唯一的血管加压素敏感性水通道。近期有AQP2穿梭机制的研究证实,存在其它非ADH介导的细胞信号转导通路,可调节AQP2在细胞膜上的积聚。其它涉及穿梭机制及AQP2基因转录刺激信号途径的因素及作用机制还尚待进一步研究。3.2 实验研究(1)家兔尿滴数检测第一阶段(平静呼吸)两组家兔尿滴数统计比较:模型组家兔与对照组家兔尿滴数差异无统计学意义(P>0.05)。第二阶段(扩肺干预)两组家兔尿滴数统计比较:模型组家兔正压扩肺时较对照组家兔尿滴数减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。第三阶段(平静呼吸):模型组家兔与对照组家兔平静呼吸状态下,两者尿滴数差异无统计学意义(P>0.05)。第四阶段(剪断神经,扩肺干预):模型组家兔正压扩肺时较对照组家兔尿滴数减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)家兔肺、肾组织病理形态学观察模型组家兔与对照组家兔肺组织结构基本正常,无明显差别;模型组家兔与对照组家兔肾组织基本正常,无明显差别。(3)家兔正压扩肺模型肾组织AQP1、AQP2基因表达水平及蛋白的变化实时荧光定量PCR法检测肾组织AQP1mRNA、AQP2mRNA水平,实验结果表明,模型组家兔与对照组家兔比较,肾组织AQP1mRNA、AQP2mRNA水平均升高。通过免疫组化SP法检测肾组织水通道蛋白AQP1、AQP2表达水平,实验结果表明,模型组家兔与对照组家兔比较,肾组织水通道蛋白AQP1、AQP2表达水平均升高。4 结论本实验中家兔正压扩肺模型复制成功。改变麻醉状态下家兔的呼吸率和潮气量后,家兔尿量总体减少。对家兔肺、肾组织病理形态学进行观察,未见模型组家兔肺、肾组织病理变化,因此对模型组家兔尿量的变化可进行进一步分子生物学机制探讨。肾组织AQP1的mRNA及蛋白相对含量升高,介导了近曲小管管腔内水的跨膜转运,增加了近曲小管对原尿的重吸收;肾组织AQP2的mRNA相对含量及蛋白升高,使远曲小管细胞膜对水的通透性增加,增加了远曲小管的重吸收作用。改变麻醉状态下家兔的呼吸率和潮气量后,家兔尿量总体减少,其相关分子生物学机制,可能与肾组织中AQP1、AQP2含量升高,肾小管对管腔中水的重吸收作用增加,因而导致终尿减少有关。提示观察AQP1、AQP2指标可作为研究“肺主通调水道”等中医水液代谢相关理论的途径之一。