研究目的:1.构建草甘膦(Gly)染毒动物体内模型,评价Gly对雄性小鼠生殖细胞毒性损伤效应。2.构建Gly损伤体外细胞模型,分析Gly对小鼠精母细胞周期和细胞凋亡的影响。3.初步探讨Gly致雄性生殖细胞毒性作用的分子机制。研究方法:(一)体内生殖毒性评价1.32只8周龄雄性昆明小鼠,随机分为4组:对照组、60 mg/kg Gly、180 mg/kg Gly及540 mg/kg Gly。Gly灌胃给药35d,构建Gly染毒体内模型。2.动物取材后计算各组小鼠睾丸、附睾脏器指数。3.西班牙CASA分析Gly染毒后各组小鼠精液质量,包括小鼠精子活动能力、小鼠精子运动各项参数、精子密度、精子数目以及精子形态。4.HE染色后,光镜下观察睾丸组织病理学改变。5.TUNNEL法检测睾丸生精细胞凋亡情况。(二)体外细胞毒性作用检测1.以永生化的小鼠精母细胞株(GC-2细胞)为对象构建体外Gly损伤细胞模型。2.倒置显微镜和透射电镜观察Gly处理后GC-2细胞形态和超微结。3.CCK8法检测草甘膦对GC2细胞增殖的影响。4.流式细胞仪检测Gly处理对GC-2细胞凋亡及周期阻滞的影响。(三)机制研究1.Western blot法检测Gly处理后GC-2细胞凋亡及周期相关蛋白的表达水平。2.采用q RT-PCR法、Western blot法及免疫荧光法检测Gly处理后GC-2细胞XAF1m RNA及蛋白表达水平。3.Western blot法及免疫荧光法检测Gly染毒小鼠睾丸组织XAF1表达水平。4.设计、合成针对XAF1的siRNA及对照siRNA,转染GC-2细胞并采用qRT-PCR法和Western blot法检测干扰效率。5.通过细胞形态学观察、流式细胞仪分析及Western Blot法观察Gly处理后,siXAF1组细胞的形态学改变,分析XAF1干扰后对小鼠精母细胞凋亡的影响。研究结果:(一)体内试验结果1.草甘膦染毒35d对小鼠饮水、进食,外观体征、行为活动、粪便性状等一般状况无明显影响;草甘膦染毒35d对小鼠体重、睾丸、附睾指数均无显著影响。2.草甘膦染毒后,60 mg/kg Gly、180 mg/kg Gly以及540 mg/kg Gly给药组小鼠的快速运动精子百分比均明显减少,且与正常对照组比较具有统计学差异(P<0.05)。草甘膦处理后各染毒组不动精子数目明显增多,其中180 mg/kg Gly以及540 mg/kg Gly剂量组不动精子数目与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);540 mg/kg Gly剂量组曲线速度(VCL)较对照组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.Gly染毒35d后,540 mg/kg Gly组精子密度及精子数目与正常对照组比较下降明显,且具有统计学意义(P<0.05)。各染毒组与正常对照组比较精子畸形率明显升高,其中180 mg/kg Gly、540 mg/kg Gly剂量组与正常对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),Gly所导致的畸形精子主要为胖头和无定型两类。4.经Gly染毒35d后,各染毒组分别出现了不同程度的病理改变,光镜下可见小鼠睾丸组织中出现大量空泡,生精细胞排列紊乱,损伤程度显示剂量依赖。其中540mg/kg Gly高剂量组病变最明显,部分曲细精管萎缩变形,管腔内精子数明显减少。5.TUNNEL法检测发现,各染毒组均明显可见凋亡细胞,并且随着染毒剂量的增加凋亡细胞明显增多,尤其是540 mg/kg Gly剂量组。进一步观察发现凋亡细胞主要为精母细胞和精子细胞。(二)体外毒性效应评价结果1.Gly染毒处理48h的GC-2细胞,在光学显微镜下可见细胞体积变小,形态变圆,细胞间隙增大,细胞数目减少,死亡细胞增多,部分细胞贴壁不牢呈漂浮状态。2.Gly(25 mg/L)处理48h后,透射电镜下可见GC-2细胞细胞核中异染色质明显边移并凝聚在周边呈新月形,表现出典型的凋亡特征。另外,草甘膦处理后,GC-2细胞内质网可见不同程度的扩张、空泡肿胀,同时可见线粒体外室肿胀。3.CCK8结果显示Gly在6.25 mg/L-25 mg/L浓度范围内可以显著抑制小鼠精母细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖性。4.流式细胞检测结果表明:随着草甘膦染毒剂量的增加,G1期细胞分布百分比呈现增高趋势,且呈剂量依赖性关系,25 mg/L染毒组GC-2细胞G1期明显高于对照组。差异具有统计学意义(P<0.05),提示草甘膦可将GC-2细胞周期阻滞在G1期。5.GC-2细胞凋亡的比例随着Gly给药浓度的增加逐渐上升,其中12.5以及25mg/L剂量组凋亡率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(三)相关机制研究结果1.草甘膦可促进G1/S期关卡负向调控因子p21蛋白的表达,降低正向调控因子Cyclin D1以及CyclinE蛋白的表达。草甘膦处理后促凋亡蛋白caspase3明显活化。2.Gly染毒48 h后,各染毒组GC-2细胞XAF1 mRNA表达水平均有所增加,其中Gly 25 mg/L剂量组增加明显,与正常对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05)。Western blot及免疫荧光结果表明Gly处理可以促进GC-2细胞XAF1蛋白的表达;3.草甘膦染毒后小鼠睾丸组织XAF1表达明显上调,尤其是180 mg/kg Gly和540mg/kg Gly剂量组,与体外实验结果一致。XAF1主要表达于精母细胞、早期及晚期精子细胞。4.siRNA转染后GC-2细胞中XAF1的m RNA以及蛋白水平均显著下降。Gly(25mg/L)处理GC-2细胞48h后,siXAF1组死亡细胞较NC组变少,细胞凋亡率明显降低,与NC组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。XAF1干扰后可以明显减弱促凋亡蛋白PARP及caspase3的活化。研究结论:1.Gly染毒35d可导致小鼠睾丸组织发生明显的病理改变,精子活力下降,精子密度降低,精子畸形率增加,提示Gly具有明显的雄性生殖毒性;2.Gly可以诱导小鼠精母细胞G1期阻滞以及细胞凋亡。体内试验也证实Gly染毒可导致小鼠生精细胞凋亡数目增加;3.p21、Cyclin D1和CyclinE参与Gly诱发的细胞周期改变。XAF1参与Gly诱导的GC-2细胞凋亡。