昆虫的蜕皮及变态过程是通过蜕皮激素和保幼激素协同作用完成。蜕皮是一个复杂的激素级联调控过程，最初通过脑激素PTTH启动蜕皮激素的分泌，在蜕皮激素的下游还有一系列的神经肽如CCAP、Bursicon等等，甚至气门内腺分泌的EH，它们各自行使不同功能，协调完成了蜕皮过程。目前，对这个复杂调控过程的了解仍然不甚详尽。而在激素调控过程中各种信号传递过程则更为复杂，并且在不同的昆虫种类中也存在差异，需要进行更深入的研究。miRNA作为真核生物体内基因调控的重要分子已经在多种模式生物中进行了大量的研究。本研究以模式昆虫家蚕为材料，对miRNA在昆虫变态发育相关基因特别是蜕皮激素信号通路基因调控中的作用机制进行了深入研究。　　1.变态发育调控通路中的miRNA靶点预测　　在模式昆虫黑腹果蝇中发现，miRNA参与了一些涉及昆虫发育与变态发育过程重要基因的调控过程。在家蚕miRNA鉴定工作的基础上，为了探究家蚕miRNA对其发育及变态发育是否也有类似的调控关系，本研究首先对家蚕miRNA靶基因进行了预测。通过对家蚕的保守miRNA和NCBI收录的全长mRNA进行miRanda、PITA和microTar多软件预测，结果表明miRNA有可能在多个发育调控关键通路中存在靶基因位点，如细胞凋亡、丝质合成、激素合成以及激素调控通路等。本文重点分析了家蚕蜕皮激素调控通路相关基因，并筛选出在此通路中的关键miRNA/靶基因进行了进一步的实验验证。　　2.家蚕miR-281在马氏管内特异性调控EcR-B亚型　　家蚕EcR基因由EcR-A、B1和B2三种不同的亚型分别行使不同生理功能。对家蚕EcR的基因结构进行具体分析，发现EcR-B1和B2的3UTR区域序列完全相同，而EcR-A亚型和两种EcR-B亚型分别由不同的外显子编码，序列没有同源性。进一步分析发现，在EcR-B亚型中存在预测的miR-279e、miR-14和miR-281的结合位点。通过在293T细胞系中转染含有EcR-B3UTR序列的报告载体，同时添加miRNA，经过双色荧光报告系统发现miR-14和miR-281对EcR-B有显著的调控。对EcR-B3UTR上的miR-281结合位点点突变，实验发现miR-281能抑制野生型序列而对突变型序列没有效果。这验证了miR-281确实通过结合此预测位点而抑制了靶基因的表达。miR-281在4龄眠期的家蚕体内表达最高，而在5龄后期逐渐降低，在蛹期第一天达到最低值，其后又逐渐回升。这与EcR-B的表达模式并不完全吻合，在每次蜕皮前，EcR-B则会随着20E的诱导而表达。同样在组织水平，miR-281在马氏管内表达最高，丝腺其次，中肠和体壁中也有分布，而EcR-B在马氏管内也是表达量最高，其余组织中呈现和miR-281的互补模式。在miR-281表达量最高的时期向家蚕体内注射miR-281抑制剂，会导致靶基因EcR-B表达量的上升，而在上蔟前注射miR-281模拟物，可以导致EcR-B的表达相对减少，这都说明miR-281在体内确实可以对EcR-B的表达产生影响。miR-281的表达在可能受到20E信号的抑制，而对JH没有明显的响应。通过以上实验说明在马氏管内，家蚕miR-281和EcR之间可能存在正反馈调控关系。　　3.E75受miR-14拘调控　　对家蚕变态发育调节基因的研究中还发现，E75基因可能是miR-14的靶基因，miR-14种子区在E75的3UTR上的结合位点很保守，在鳞翅目昆虫中普遍存在，甚至还包括了双翅目的果蝇。双色荧光报告实验说明，E75的点突变型3UTR无法和野生型那样受到miR-14的调控。对miR-14表达谱的研究发现，其表达模式和miR-281类似，都在4龄眠期达到表达高峰。然而通过激素诱导实验发现，miR-14不被20E调控，但在丝腺中则受到JH的诱导。从家蚕到果蝇，miR-14对E75，EcR-B的调控作用显示出保守性，从一个侧面证明了miRNA在昆虫的蜕皮激素调控中应当发挥了重要的作用。　　4.转基因家蚕应用于miRNA功能研究　　除果蝇以外，在昆虫中对miRNA的功能研究还缺乏必要的遗传操作手段。由于家蚕的遗传操作体系已经相对成熟，在本研究中尝试引入果蝇转基因RNAi体系(TriP)，利用piggybac转基因系统对miRNA进行过表达或者抑制表达（或敲除）。将pVALUM20载体功能片段与家蚕pBA C(3×P3-ECFPafm)SIPPE载体进行连接，再导入miR-281前体发夹序列得到融合转基因载体结构。用显微注射的方法将质粒载体转入家蚕卵内。筛选得到的G1代阳性转基因蚕与Gal4品系进行杂交，在G2代双阳性蚕中，可以检测到初级转录产物的表达，但是缺乏miRNA的成熟体序列。其原因可能是在体内这种转录产物无法被有效剪切。在后续试验中需要对载体进行再次改造，更换效果已验证的元件，为更深入的研究打下基础。