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脂肪酶(EC3.11)作为绿色生物催化剂,广泛应用于生物制药、食品加工、化学分析等领域。固定化为提升酶重用性及稳定性提供了一种有效的解决途径,而以磁性纳米粒子为固定化载体可以更为方便快捷地回收酶。本文围绕磁性纳米粒子,制备出三种复合载体,包括化学共沉淀法制备得到磁性氧化石墨纳米复合物(MGO)、表面活性剂改性磁性氧化石墨烯(SMGO)和表面活性剂改性Fe304磁性纳米粒子(Span/Tween Fe304),探讨三种载体用于褶皱假丝酵母脂肪酶(CRL)的固定化效果,并重点研究表面活性剂改性载体对脂肪酶催化特性的影响。采用正交实验对MGO载体的制备进行优化,以酶活与比活为考察指标,得到MGO的最佳制备工艺。傅里叶红外光谱(FT-IR)与扫描电镜(SEM)表征分析表明MGO制备成功,GO表层的羧基官能团在强碱条件下被部分还原,导致MGO表面羧基含量明显减少。在最优固定化条件下,固定化酶活力回收率及蛋白回收率分别为92.41%、88.2%。固定化酶重复利用第二次相对酶活下降至40%左右,推测MGO载体上固定的脂肪酶大部分为物理吸附,极少部分为共价固定。采用化学共沉淀法制备MGO,直接在反应体系中加入Span系列表面活性剂,一锅法制备得到表面活性剂改性磁性氧化石墨烯(SMGO)。X射线衍射仪(XRD)、SEM和FT-IR表征结果表明SMGO制备成功,且具有良好的磁分离性能。以戊二醛(GA)为交联剂,褶皱假丝酵母脂肪酶(CRL)为模型酶,共价固定CRL于SMGO载体上。Span40MGO固定化酶酶活回收率为116.5%±1.7,为MGO固定化酶的6倍;比活可达32.5U/mg,为游离酶的1.6倍;Keat/Km也有较大的提升,高于游离酶50%。储存稳定性及热稳定性得到提高,用于水解反应6批次后仍然保留73.60%的相对酶活力。初步分析认为MGO经改性后表面从亲水性转为疏水性,使得CRL在共价固定化过程中同时发生疏水界面活化,这是酶活性提高的原因之一。此改性策略可为类似载体改性提供新思路。对于Span/Tween Fe3O4载体来说,,Span系列改性Fe3O4制备的固定化酶蛋白回收率及酶活回收率均高于Tween系列改性,认为原因在于Tween/Span系列表面活性剂改性载体表面亲疏水性能的差异。动力学测定表明,Span Fe304固定化酶拥有更高的催化效率,Span40Fe3O4固定化酶Kcat/Km为33.38s-1.mM-1,为游离酶的1.7倍,为Fe304固定化酶的6.9倍,说明脂肪酶CRL在固定在疏水性Span40 Fe3O4载体表面时其催化活力中心被更多的暴露于底物,酶催化性能得到激活,疏水性表面活性剂改性磁性纳米粒子更适用于脂肪酶的固定化。在最佳固定化条件下,固定化酶活力回收为112.8%,总酶活为19.2U,固定化酶重用6次依然保留72.7%的相对酶活力,固定化酶储存稳定性,热稳定性均得到一定程度的提升。Span40 Fe304制备方法简单且廉价易得,能够在共价固定脂肪酶的同时实现脂肪酶的界面活化,从而提升固定化酶催化性能,为固定化酶的工业化应用提供了一种可行的固定化策略。