论文部分内容阅读
大薯(Dioscorea alata L.)是一类热带块茎作物,营养价值高,生长于高温高湿的热带或亚热带地区,种植过程易遭受炭疽菌侵染,对生产危害大,目前主要的防治措施为化学防治。本研究拟采用茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)和水杨酸(Salicylic acid,SA)诱导大薯炭疽病抗性,并探究其抗病机理。本研究通过统计炭疽菌孢子萌发率和抑菌圈,检测MeJA和SA对炭疽菌的毒力。将炭疽菌接种于感病大薯种质Da90的植株上,用MeJA和SA诱导后,利用光学显微镜观察叶片表面孢子萌发和菌丝生长情况,利用透射电镜观察菌丝的侵染和扩展情况以及叶肉细胞超微结构的变化,采用荧光定量PCR技术分析不同激素诱导下PR基因家族的表达情况,筛选出与病程相关的PR(pathogenesis-related)基因进行亚细胞定位,同时检测β-1,3葡聚糖酶和几丁质酶的酶活变化。主要研究结果如下:1、设置 MeJA 和 SA 浓度分别为 0(对照)、0.025、0.05、0.1、0.2 和 0.4m M,探究MeJA和SA对炭疽菌活力的影响。结果显示:MeJA浓度为0.025和0.1m M,SA浓度为0.025、0.1和0.4mM时,炭疽菌孢子的萌发率比对照低(差异不显著)。MeJA浓度为0.05、0.2和0.4mM,SA浓度为0.05和0.2mM时,炭疽菌孢子萌发率比对照高(差异不显著)。抑菌圈法结果表明,MeJA和SA平板上无抑菌圈产生。表明MeJA和SA对炭疽菌无直接毒害作用。2、在炭疽菌、炭疽菌+MeJA、炭疽菌+SA、MeJA和SA五种诱导下,光学显微镜和透射电镜观察1d、3d和5d时,大薯叶片表面孢子萌发和菌丝生长情况,菌丝的侵染和扩展情况以及叶肉细胞超微结构的变化,结果表明:感病大薯叶片上孢子萌发速度快,菌丝成网状、覆盖面积大,在接种1d和3d时细胞内叶绿体降解,出现质壁分离,5d时细胞破裂死亡。与感病大薯对比,外源MeJA或SA诱导下,大薯叶片表面菌丝较少,覆盖面积小,孢子萌发速度慢。与单独炭疽菌处理相比,外源MeJA诱导下,5d时叶绿体膨大。外源SA诱导下,1d时叶绿体膨大,3d时叶绿体内淀粉体产生。3、根据前期转录组数据,筛选13个与MeJA和SA抗病途径相关的PR基因,进行荧光定量PCR表达分析,结果表明:与对照吐温水处理比较,炭疽菌+MeJA处理时DaPR1-2基因表达量在4d时达到峰值,DaPR1-1表达量仅次于DaPR1-2,差异均显著。炭疽菌+SA处理时DaPR1-2基因表达量在3d时达到峰值,差异显著。MeJA处理时DaPR1-8基因表达量在5d时高于其他PR基因的表达量,达到峰值,差异显著。SA处理时DaPR4-1基因表达量在5d时达到峰值,差异显著。炭疽菌处理时DaPR4-1基因表达量在4d时达到峰值,差异显著。其余PR基因的表达量,在炭疽菌+MeJA和炭疽菌+SA诱导下,均在第2d和第4d时上调,在MeJA、S A和炭疽菌诱导下没有明显波动。在炭疽菌+MeJA、SA诱导下表达量显著增高的D aPR1-2和DaPR1-1蛋白均定位于细胞核上。4、对炭疽菌、MeJA和SA的五组处理Od(对照)、1d、3d和5d时,进行β-1,3葡聚糖酶和几丁质酶活检测,结果表明:与对照比较,只有MeJA处理1d时和炭疽菌单独处理3d时,β-1,3葡聚糖酶活高于对照,前者差异不显著,后者差异显著,其中,炭疽菌处理3d时酶活达到峰值,P值为0.02,差异达到显著,炭疽菌+MeJA处理1d时酶活最低,P值为0.001,差异极显著。五种不同处理下β-1,3葡聚糖酶的酶活没有明显的变化。而只有MeJA诱导下1d和3d时几丁质酶活高于对照,差异均不显著,MeJA诱导下3d时达到峰值,P值为0.36,差异不显著,炭疽菌+MeJA处理5d时酶活最低,P值为0.005,差异极显著。五种不同处理下几丁质酶的酶活相较于对照出现了下调。说明外源MeJA和SA诱导下,不是通过β-1,3葡聚糖酶和几丁质酶来提高大薯对炭疽菌的抗性。