研究背景及目的抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)主要临床病史包括血栓形成和/或病理妊娠,临床上将临床病史表现为病理妊娠,没有血栓病史的APS患者称为产科APS(obstetric APS,OAPS)。根据2006年悉尼诊断标准,病理妊娠包括:妊娠10周之前复发性流产、妊娠10周之后胎儿丢失、胎儿生长受限、子痫前期或因胎盘功能不全导致的早产等。实验室诊断包括2次及2次以上检测抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibody,aCL)或抗β 2糖蛋白Ⅰ抗体(anti-β2 glycoprotein I antibodies,a β2GPI)IgM 和/或 IgG 中高滴度阳性,或者狼疮抗凝物(lupus anticoagulant,LA)阳性,2次检测时间间隔至少大于12周。目前对于OAPS常规治疗方法为低剂量阿司匹林联合预防剂量低分子肝素治疗,80%以上OAPS患者可以成功妊娠,但仍有部分患者妊娠期间出现妊娠并发症,提示OAPS发病机制需要进一步探索。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是中性粒细胞活化发挥功能的方式之一,其形成过程称为NETosis。NETs最先在感染性疾病中发现,随着研究进展,NETs与非感染性疾病的关系逐渐显现出来。NETs主要由DNA骨架及附着其上的各种蛋白酶类组成,主要包括髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO),中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE),组织蛋白酶G等。不同的刺激物诱导形成的NETs,其内容物可能不同,不同的内容物具有不同的生物学功能。调控NETs释放的分子机制多样,随刺激物的不同而有所差异。诸多研究表明,NETs的释放依赖呼吸爆发,并与Raf/MEK/ERK等胞内信号通路有关。PI3K/AKT通路被证明在特定免疫复合物刺激NETs形成过程中起重要作用。Hiromichi等研究表明抑制PI3K会同时下调AKT和Raf/MEK/ERK通路。另外,Thiago等人认为,PI3K,AKT及其下游ERK的激活对于依赖活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成的 NETs 非常重要。NETs中的RNA-LL37复合物可以通过作用于Toll样受体8(Toll-like receptor 8,TLR 8)促进细胞因子和趋化因子的释放,并且可以激活中性粒细胞释放更多的NETs,这或许在银屑病发病机制中具有重要作用。在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)中,来自 NETs 的 DNA-LL37 复合物通过TLR9激活多克隆B细胞促进其释放自身抗体,自身抗体与抗原形成免疫复合物,沉积在外周组织,进而引起有害的炎症反应。在动脉粥样硬化性疾病中,胆固醇促进NETs释放,进而使巨噬细胞释放白介素1 β(IL-1β)等细胞因子,并激活Th17细胞。在抗磷脂抗体(antiphospholipid antibodies,aPLs)导致的子痫前期、胎儿生长受限等产科并发症的胎盘组织中发现有大量中性粒细胞聚集,清除体内中性粒细胞之后,抗磷脂抗体介导的产科并发症不再出现。在SLE及子痫前期患者胎盘中,发现绒毛外间隙有大量NETs浸润。胎盘形成障碍是导致复发性流产、子痫前期、胎儿生长受限等产科并发症的主要原因,而滋养细胞及内皮细胞的正常生物学功能对胎盘形成至关重要。抗磷脂抗体可以降低滋养细胞迁移和侵袭能力,亦可以损害内皮迁移及血管形成功能,其发生机制不清楚。因此,本研究拟通过检测早孕期OAPS患者血清中NETs水平的变化观察抗磷脂抗体对NETs生成的影响,进而探索抗磷脂抗体刺激NETs释放的分子机制,并探究抗磷脂抗体诱导的NETs对滋养细胞及内皮细胞的生物学功能影响。实验方法1.样本收集22例早孕期产科抗磷脂综合征患者与22例匹配孕周的早孕期正常妊娠妇女新鲜外周血均来自山东大学附属省立医院。所有志愿者均获得知情同意,研究经医院伦理委员会批准。2.血清中NETs标志物检测利用 Quant-iTTM PicoGreen dsDNA Reagent and Kits试剂盒检测血清中细胞游离DNA的水平,用ELISA法检测血清中NETs标志物MPO-DNA,MPO,NE的水平。3.人外周血中性粒细胞分离使用PolymorphprepTM分离液应用密度梯度离心法,分离人外周血中性粒细胞,台盼蓝染色检测中性粒细胞活性。4.中性粒细胞静息状态下NETs释放实验利用 Quant-iTTM PicoGreen(?)dsDNA Reagent and Kits 试剂盒、活细胞荧光染色检测早孕期OAPS患者及正常妊娠孕妇体内中性粒细胞在未刺激状态下NETs释放的水平。5.人血清中IgG纯化利用NAbTM Protein A Plus Spin试剂盒分离纯化血清中lgG,BCA法检测蛋白浓度。6.抗磷脂抗体对NETs释放的影响用15 μ g/mL早孕期OAPS患者血清中提纯的IgG(APS-IgG)刺激正常孕妇中性粒细胞 2-4小时,Quant-iTTM PicoGreen’ dsDNA Reagent and Kits试剂盒、活细胞荧光染色检测NETs释放的水平。7.ROS释放在抗磷脂抗体诱导NETs释放中的作用利用DCFH-DA活性氧检测试剂盒及荧光酶标仪检测抗磷脂抗体对中性粒细胞ROS释放的影响。使用NADPH氧化酶抑制剂DPI预先处理正常孕妇中性粒细胞30分钟,再用抗磷脂抗体刺激 2-4 小时,使用 Quant-iTTM PicoGreen’ dsDNA Reagent and Kits试剂盒、活细胞荧光染色检测NETs释放的水平,观察ROS对NETs释放的影响。8.Akt、ERK、p38-MAPK的磷酸化对抗磷脂抗体诱导NETs形成的影响Western blot检测抗磷脂抗体对Akt、ERK、p38-MAPK磷酸化水平的影响。使用Akt、ERK、p38-MAPK磷酸化抑制剂预先处理正常孕妇中性粒细胞30分钟,再用抗磷脂抗体刺激 2-4 小时,使用 Quant-iTTM PicoGreen*dsDNA Reagent and Kits试剂盒、活细胞荧光染色检测NETs释放的水平,观察Akt、ERK、p38-MAPK的磷酸化水平对NETs释放的影响。9.体外NETs分离使用抗磷脂抗体、正常对照IgG或PMA刺激正常孕妇中性粒细胞4小时后,利用细胞刮剧烈搅动后离心收集NETs,Quant-iTTM PicoGreen(?)dsDNA Reagent and Kits试剂盒检测NETs中游离DNA水平,BCA法进行蛋白定量。10.APS-IgG诱导形成的NETs对滋养细胞迁移及侵袭功能的影响APS-IgG诱导形成的NETs处理滋养细胞12-24小时,Transwell迁移实验、划痕实验检测滋养细胞迁移能力的改变,Transwel l侵袭实验检测滋养细胞侵袭能力的改变。11.APS-IgG诱导形成的NETs对内皮细胞迁移及血管形成功能的影响APS-IgG诱导形成的NETs处理内皮细胞12-24小时,Transwell迁移实验检测内皮细胞迁移能力的改变,血管形成实验检测内皮细胞血管形成能力的改变。实验结果1.早孕期OAPS患者血清中细胞游离DNA水平及NETs标志物水平较正常妊娠者升高与正常早孕期妇女相比,早孕期OAPS患者血清中细胞游离DNA水平及NETs标志物MOP-DNA、MPO、NE均升高;且与抗磷脂抗体阳性但无病理妊娠病史者、抗磷脂抗体阴性但有病理妊娠病史者相比,早孕期OAPS患者血清中游离DNA水平升高。2.早孕期OAPS患者中性粒细胞与正常孕妇中性粒细胞相比,更容易释放NETs通过检测游离DNA及细胞荧光染色,与正常早孕期妇女中性粒细胞相比,OAPS患者中性粒细胞NETs形成释放能力显著增加。3.抗磷脂抗体刺激正常孕妇中性粒细胞后NETs释放增多抗磷脂抗体、健康对照IgG、PMA分别刺激正常早孕期妇女中性粒细胞,检测细胞游离DNA及活细胞成像显示,抗磷脂抗体促进NETs释放,其刺激释放水平与PMA相当,而健康对照IgG对NETs释放没有影响。4.抗磷脂抗体通过促进ROS释放进而增加NETs释放水平抗磷脂抗体、健康对照IgG、PMA分别刺激正常早孕期妇女中性粒细胞,DCFH-DA标记活性氧,荧光酶标仪检测荧光强度显示,抗磷脂抗体促进ROS释放,且该释放过程部分依赖NADPH氧化酶。应用NADPH氧化酶抑制剂DPI预处理中性粒细胞可以抑制抗磷脂抗体引起的NETs释放。5.抗磷脂抗体通过促进Akt、ERK、p38-MAPK的磷酸化水平促进NETs释放抗磷脂抗体、健康对照IgG、PMA分别刺激正常早孕期妇女中性粒细胞,Western blot结果显示,抗磷脂抗体促进Akt、ERK、p38-MAPK的磷酸化。应用Akt、ERK、p38-MAPK磷酸化抑制剂分别预处理中性粒细胞可以抑制抗磷脂抗体引起的NETs释放。6.抗磷脂抗体诱导生成的NETs抑制滋养细胞迁移和侵袭能力,并抑制内皮细胞的迁移和血管生成能力抗磷脂抗体诱导的NETs作用于早孕期绒毛外滋养细胞株HTR-8/Svneo,Transwell迁移实验、划痕实验结果显示滋养细胞迁移能力降低,Transwell侵袭实验结果显示滋养细胞侵袭能力降低;抗磷脂抗体诱导的NETs作用于人脐静脉内皮细胞(HUVEC),Transwell迁移实验结果显示内皮细胞迁移能力降低,血管形成实验结果显示内皮细胞血管形成能力降低。结论早孕期OAPS患者血清中NETs生成增多,抗磷脂抗体通过促进ROS释放及Akt、ERK、p38-MAPK磷酸化促进NETs释放,损害滋养细胞迁移及侵袭能力和内皮细胞迁移及血管形成能力,影响胎盘形成过程,进而导致病理妊娠发生。