研究背景和意义锰作为一种必需微量元素可以维持人体正常的生理功能,而摄入过量的锰则会对机体产生毒性损伤。近年来由于经济生活的发展和工业环境的变化,环境中锰的含量逐渐升高,锰的毒性危害也日益受到人们的重视。锰的主要毒作用器官是神经系统,早期以神经衰弱综合征和植物神经功能紊乱为主,继而可出现明显的锥体外系神经受损症状,与帕金森病(Parkinson’s disease,PD)症状类似,流行病学研究认为锰是PD发病的环境危险因素之一。以往对锰神经毒性的研究多关注锰对神经元尤其是多巴胺能神经元的直接损伤,而中枢神经系统中占绝大多数的神经胶质细胞在锰引起的神经毒性中的作用却一直被忽视。小胶质细胞是脑内重要的免疫反应活性细胞,它的激活不是对死亡细胞进行清除,而是参与到神经元损伤的启动和放大过程。激活的小胶质细胞可以调节细胞因子如IL-1β、TNF-a以及过氧化物如一氧化氮(NO)的水平;这些前炎症细胞因子或活性氧化分子所形成的级联效应形成恶性循环,最终导致神经元的损伤或丢失。近年的研究表明,小胶质细胞的激活在帕金森病的病理发生中具有极为关键的作用。因此本研究试图探讨锰的神经毒性是否与小胶质细胞的活化有关;小胶质细胞的激活与中脑多巴胺能神经元损伤之间的关系;通过以米诺环素等抑制小胶质细胞活化或其活化产物的表达,能否对锰引起的神经毒性发挥保护作用,从而进一步阐明锰神经毒性的分子机制。研究目的1、用小胶质细胞与中脑多巴胺能神经元建立Transwell共培养模型,研究锰对小胶质细胞以及多巴胺能神经元损伤的影响。2、用Transwell共培养模型研究小胶质细胞活化及其活化产物在锰诱导的多巴胺能神经元损伤中的作用机制;利用米诺环素等抑制剂拮抗小胶质细胞活化及其活化产物的表达,阐明其对多巴胺能神经元损伤的保护作用。研究方法1、用原代培养的方法建立小胶质细胞与中脑多巴胺能神经元体外培养的Transwell细胞模型。2、用免疫组织化学法检测锰刺激对小胶质细胞活化的影响;用TH、TUNEL双标法检测中脑多巴胺能神经元的损伤情况。3、用免疫组织化学法检测小胶质细胞活化产物iNOS的表达水平;ELSIA方法检测小胶质细胞活化产物IL-1β、TNF-a的表达水平。研究结果1、用原代培养的方法纯化出的小胶质细胞纯度大于98%;中脑多巴胺能神经元纯化后纯度达到2%,符合建立实验模型的纯度要求。2、以300μmol/L氯化锰单独刺激上层小胶质细胞48h后将小胶质细胞培养层加入共培养模型内继续培养48h,免疫细胞化学法的结果显示染锰组小胶质细胞的活化程度(75.1%±8.6%)与对照组相比(26.7%±4.5%)明显升高,提示锰可以引起小胶质细胞的活化;染锰组中脑多巴胺能神经元的阳性细胞数(6.8±0.73)与对照组(39.71±2.86)相比明显降低,提示锰诱导的小胶质细胞活化对多巴胺能神经元有一定程度的损伤,并且在统计学上有显著性差异(p<0.01),3、将纯化后的小胶质细胞分为正常对照组、300μmol/L染锰组、300μmol/L染锰+300μmol/L SMT(iNOS抑制剂)组,不同浓度的锰或SMT单独作用小胶质细胞48h后,将含有小胶质细胞的半透膜小皿放回接种了中脑多巴胺能神经元的Transwell共培养板中,继续培养48h,免疫组化检测iNOS的表达水平结果显示对照组显著低于染锰组(p<0.001),染锰+SMT组低于单独染锰组,并且在统计学上有显著性差异(p<0.01);中脑多巴胺能神经元在SMT拮抗了小胶质细胞iNOS的表达后其损伤程度与单独染锰组相比明显降低,在统计学上有显著性差异(p<0.01)。4、将纯化后的小胶质细胞分为对照组、300μmol/L染锰组、300μmol/L染锰+45μmol/L米诺环素拮抗组。不同浓度的锰或米诺环素单独作用小胶质细胞48h后,将半透膜小皿放回接种了中脑多巴胺能神经元的Transwell共培养板中,继续培养48h,免疫组化检测显示,小胶质细胞在拮抗剂米诺环素的作用下活化程度明显低于染锰组;小胶质细胞活化产物在拮抗剂米诺环素的作用下,其表达量与单独染锰组相比明显降低;中脑多巴胺能神经元在米诺环素拮抗了小胶质细胞的活化产物后,其损伤程度明显减小,并且在统计学上有显著性差异(p<0.01)。研究结论1、基于中脑多巴胺能神经元与小胶质细胞原代培养所建立起来Transwell共培养模型对于小胶质细胞活化在锰诱导的多巴胺能神经元损伤中的作用及可能机制的实验研究具有可行性和可信性。2、锰可以诱导小胶质细胞活化以及中脑多巴胺能神经元的损伤。3、锰可能是通过激活小胶质细胞活化以及调节小胶质细胞活化产物的表达水平从而诱导中脑多巴胺能神经元的损伤;米诺环素和SMT可能是分别通过抑制小胶质细胞活化和活化产物的表达发挥对锰诱导的中脑多巴胺能神经元损伤的保护作用。