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血小板衍化生长因子(PDGFs)及其受体(PDGFRs)作为生长因子和酪氨酸受体激酶的典型代表研究已有三十余年。研究表明,成纤维细胞和紧邻基质的上皮细胞和内皮细胞等均表达PDGFs,后者具有促进这些细胞分裂、增殖和分化以及合成、分泌细胞外基质的功能,并在结缔组织重塑中发挥重要调节作用。近年研究表明:PDGF/PDGFR 信号转导途径与胚胎发育、正常生理功能维持、疾病发生以及组织损伤后的修复等密切相关,对哺乳动物发育阶段的器官形成亦至关重要,包括肾脏、睾丸、肠、血管、皮肤、毛发、肺以及中枢神经系统的发育。在哺乳动物消化道形成过程中,PDGFAA/PDGFRα信号分子为消化管上皮正常形成所必需,并可通过旁分泌或内分泌等方式,调节胃肠壁间质细胞的分化及增殖。目前有关PDGFAA/PDGFRα的研究主要集中在胚胎发育期,对成年哺乳动物的研究较少,仅见日本学者对成年小鼠PDGFRα的研究,结果提示PDGFRα广泛表达于胃肠肌组织内的间质细胞。
近年临床研究发现,PDGFRα基因的活性突变与间质肿瘤,如皮肤、胸腺、肺、胰腺、前列腺以及卵巢等密切相关；部分胃肠间质瘤亦可见PDGFRα基因的活性突变,提示该肿瘤细胞可能起源于PDGFRα前体细胞,但目前多数研究认为胃肠间质瘤来源于胃肠的Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs),故有必要明确PDGFRα阳性细胞与ICCs的关系。而且,有关PDGFAA/PDGFRα除小鼠外,在其它成年哺乳动物胃肠组织的分布及可能作用尚不清楚。因此,本实验以成年豚鼠为实验对象,分别制作冰冻切片和分层铺片,包括胃、小肠和结肠等部位,利用免疫细胞化学染色、双重标记技术、Western Blot等方法综合分析胃肠壁内PDGFAA及其受体PDGFRα的分布和可能作用,明确PDGFRα阳性细胞和ICCs的关系,并确定PDGFRα阳性细胞的类型,为阐明PDGF/PDGFR信号分子在成年胃肠结构与功能以及胃肠损伤修复中的作用提供重要的形态学依据,为临床探讨胃肠间质瘤的发生机制及研发新的靶向治疗药物奠定理论基础。
主要结果如下:
一、Western Blot 结果:
Western blot分析结果表明:PDGFAA蛋白主要存在于消化管的黏膜层,包括胃、小肠、大肠；但其受体PDGFRα蛋白存在于消化管的肌层。为进一步明确PDGFAA及其受体PDGFRα表达的细胞种类,本研究进行了免疫荧光染色。
二、免疫细胞化学染色结果:
1.PDGFAA的分布:免疫荧光染色显示PDGFAA阳性细胞主要分布在胃肠道的粘膜层,在胃组织,PDGFAA 主要分布在胃底腺细胞,而在小肠和结肠,PDGFAA 主要存在于粘膜的上皮细胞；在消化管肌层,仅在结肠的纵肌层有少量的PDGFAA 阳性细胞。这一所见与 Western blot 结果一致,推测 PDGFAA 可能参与胃肠上皮细胞的分裂、增殖、分化以及胃肠黏膜上皮损伤修复的调节。
2.PDGFRα的分布:免疫荧光染色显示,PDGFRα广泛分布于胃肠道,主要位于上皮下结缔组织细胞和肌层内。分层铺片免疫荧光染色可见,肌层中的PDGFRα阳性细胞因分布部位不同形态上存在一定差异。在环肌层内和纵肌层内的PDGFRα 阳性细胞为双极,胞体呈长梭形,常伸出细长的突起；而在肌间神经丛周围,PDGFRα阳性细胞常位于神经节和神经纤维束周围,胞体呈不规则形,为多极,常伸出 3 个以上突起,突起反复分支,彼此间相互连接形成细胞网络,与胃肠肌层Cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal,ICCs)分布非常相似。浆膜下层内的PDGFRα阳性细胞胞体较大,形状不规则,多个较细的突起伸向不同方向,在浆膜下层形成独立的细胞网络。
3.为明确PDGFRα阳性细胞与Cajal 间质细胞的关系,本研究利用全层铺片,进行PDGFRα与C-Kit(ICCs的特异标志物)的双重免疫荧光染色。结果表明:C-Kit/PDGFRα双标未见 PDGFRα 阳性细胞表达c-Kit,无重叠染色,二者分别存在于不同的细胞。有趣的是 PDGFRα 阳性细胞常与ICCs相伴行,走行在肌细胞间和肌间神经丛周围,各自形成独立的细胞网络。与 ICCs 相比,PDGFRα 阳性细胞的胞体较大,形态不规则,除有细长的突起外,常有短的小突起,形态上与成纤维细胞类似,推测可能对 ICCs的结构和功能具有一定的保护作用。
4.为进一步明确:PDGFRα 阳性细胞的性质,本实验进行了成纤维细胞标志物 Vimentin与PDGFRα的双重免疫荧光染色,结果表明PDGFRα阳性细胞均呈Vimentin 阳性,提示 PDGFRα 阳性细胞可能为成纤维细胞的一个亚型。成纤维细胞中存在大量的PDGFRα,提示该生长因子受体信号分子可能参与胃肠术后伤口愈合的调节。另外,成纤维细胞表达PDGFRα也为临床探讨胃肠间质瘤的发病机制和治疗提供了新的形态学依据。