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丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)主要以血液和性传播,其感染后,极易发展为慢性丙型肝炎,部分患者进一步转化为肝硬化或肝细胞癌,严重危及人们的生命[1]。其发病隐匿,症状不典型,加之公众对其认知水平较低,因此病毒的传播不易控制,患者也容易因不能及时诊断而错过治疗的最佳时机。因此,及时对HCV相关指标进行检测,对于控制HCV传播、早期诊断以及提高治疗效果有着至关重要的意义。
HCV抗体检测诞生于20世纪90年代初,是最早用于HCV实验室诊断的方法,具有操作简便、耗时短等优点,被广泛运用于血液制品的筛查和临床诊断。最常用的抗-HCV诊断试剂采用间接酶联免疫法(ELISA),根据包被抗原的组成和质量的不同,抗-HCV检测试剂的发展经历了三代。目前我国最常采用的是第三代抗-HCVELISA试剂,其质量虽较前两代已有很大提高[2],但仍然存在一定程度的漏检和假阳性[3.4]
本论文的设计思路是:利用链亲和素(SA)与生物素能高效、特异结合的特性,制备HCV免疫学诊断抗原与SA的融合蛋白,并初步探讨其在抗-HCVELISA检测中的应用,以期达到更好的检测效果。
方法:构建了HCV免疫学诊断抗原(C44P)与链亲和素(SA)融合蛋白重组表达质粒pET-11d-C44P-SA,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并用Westernblot进行鉴定,表达的融合蛋白经镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,透析复性后分别包被生物素化以及普通酶联板,进行人血清抗-HCV检测。
结果:成功构建了带有SA标签的重组表达质粒,其在大肠杆菌BL21(DE3)中实现高效表达,制备的融合蛋白纯度可达90%以上,建立ELISA法进行人血清抗-HCV检测显示:融合蛋白包被生物素化酶联板的检测灵敏度与特异性明显高于普通酶联板。
结论:构建的融合蛋白作为包被抗原,利用SA标签与生物素化酶联板的高效、特异结合,提高了抗-HCV检测的灵敏度与特异性,为进一步提高抗-HCV检测试剂的质量打下了基础。