背景：筋膜学说认为,人作为一个有机整体从筋膜学角度上可划分为两个系统,即支持与储备系统和功能系统。生物通过支持储备系统来维持较长的生命周期以及维持机体稳定的内环境。功能系统在支持与储备系统支持下维持结构与功能的相对稳定,支持与储备系统则不断的为功能系统的细胞更新和功能活动提供细胞源泉和细胞活动所需的营养物质。功能系统是以功能细胞的专能特化为特点,而作为支持与储备系统的筋膜支架是以非定向干细胞为核心,通过向各种定向干细胞分化,进而分化为功能细胞。支持与储备系统不断为功能系统的更新提供细胞补充,并为功能系统的各种细胞的更新、代谢提供了一个稳定的内环境。肿瘤是机体在各种致癌因素作用下,局部组织的某些细胞在基因水平上突变,从而失去对其增殖的正常调控,导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。主要致癌因素有：化学诱变剂、X线、放射线辐射、病毒感染以及长期物理刺激等等。这些因素皆可引起基因突变,促使细胞的生长与分裂失控。筋膜学说认为,正常功能细胞在损伤的过程中会释放细胞因子诱导定向干细胞向功能细胞分化,来补充损伤死亡的细胞,定向干细胞在分化的过程中又释放干细胞趋化因子趋化招募干细胞向定向干细胞的所在部位移动并穿过基底膜分化为定向干细胞。而在肿瘤的发生过程中,基因突变导致细胞的异常增殖分裂失控,相当于定向干细胞分化出不具备正常生理功能的功能细胞,定向干细胞的分化又产生干细胞趋化因子,诱导干细胞向定向干细胞集中和穿过基底膜补充定向干细胞的消耗,此过程的不断重复导致肿瘤的增大。同时如果大量的干细胞穿过基底膜就会导致基底膜的崩溃,干细胞与定向干细胞之间失去了基底膜的屏障,定向干细胞产生的趋化因子和定向分化因子对会在基底膜深层发生,肿瘤的侵袭转移正是这种现象在局部的体现。乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一,约占25%。几乎所有患者在术后要接受放射治疗,术后放射治疗已经成为临床治疗的常规手段。但是部分患者的局部控制以及生存率并没有得到很好的改善。特别是为了得到美观而进行乳房再造的患者尤其是自体脂肪移植填充再造的患者,术后存在很大复发的风险。有研究报道,保乳手术术后复发率和乳房全切术相比,保乳手术术后复发率高。脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, AMSCs)筋膜脂肪组织中具有干细胞特性的细胞群,是从筋膜结缔组织中获取的一类具有多向分化潜能的成体干细胞。Zuk等首次从人的脂肪组织悬液中分离出了可以在体外稳定增殖、具有多向分化能力的脂肪组织提取细胞(processed lipoaspirate cells, PLA细胞),与我们研究的AMSCs是一致的。与其它成体干细胞比较,AMSCs具有来源广泛、取材方便,创伤小且不存在免疫排斥反应等优点。大量文献报道,AMSCs具有跨胚层的多向分化潜能。AMSCs可作为干细胞种子细胞,通过分化对功能细胞进行补充,也可刺激机体分泌各种因子,促进机体的损伤修复。在诱导分化作用下,AMSCs可以分化为中胚层来源的脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞,外胚层来源的神经细胞,也可以分化为内胚层来源的内皮细胞,及肝细胞等。由于AMSCs具备上述特性,有研究报道,用AMSCs治疗乳腺癌术后组织损伤,促进了伤口的愈合,得到了很好的临床效果。但是有研究表明,AMSCs可以促进乳腺癌术后复发。所以,AMSCs用于乳腺癌术后重建及损伤修复的安全性有待于进一步研究。目的通过观察体夕AMSCs对乳腺癌细胞电离辐射敏感性的影响以及体内移植瘤辐射抵抗的分析,探讨AMSCs对乳腺癌辐射敏感性影响以及其作用机制,为临床乳腺癌术后治疗以及术后乳房脂肪填充再造的风险性的评估提供部分实验依据,进一步为筋膜学说有关干细胞与肿瘤的假说提供部分实验佐证。1、通过对酶消化法分离培养AMSCs,观察非特异性筋膜结缔组织中是否存在AMSCs,乳腺癌患者来源与肥胖患者来源的AMSCs进行比较,观察两种患者组织来源AMSCs的不同；2、应用AMSCs上清液培养乳腺癌细胞,观察乳腺癌细胞增殖情况,AMSCs能否促进乳腺癌细胞,这是本实验的前提；3、通过Transwell法,共培养AMSCs和乳腺癌细胞,观察乳腺癌细胞能否趋化间充质干细胞,对AMSCs有趋化招募作用；4、通过克隆形成实验、DNA损伤修复实验,观察AMSCs上清液培养的乳腺癌细胞对电离辐射的抵抗情况,AMSCs上清液能否促进乳腺癌细胞对电离辐射的抵抗；5、Western Blot及Elisa酶联免疫吸附实验等技术检测AMSCs和乳腺癌细胞中IGF-1及IGF-1R的表达,初步探讨AMSCs促进辐射抵抗的机制；6、AMSCs和乳腺癌细胞悬液移植于BALB/c-nu/nu小鼠皮下,观察皮下移植瘤对电离辐射抵抗情况,进一步验证AMSCs是否促进乳腺癌对电离辐射的抵抗。方法1、抽脂来源的脂肪组织,通过酶消化法分离、培养AMSCs.通过形态学、功能学、流式细胞术鉴定所分离、培养的细胞是否具有间充质干细胞的特性,来判断所获取的脂肪组织中是否具有间充质干细胞。2、细胞培养：本实验MCF-7和BT474两株乳腺癌细胞系。AMSCs和MCF-7用高糖DMEM加10%胎牛血清(100μ/ml青霉素和100μ/ml链霉素)培养,BT474细胞系用RPMI1640加10%胎牛血清(100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)培养。所有的细胞置于5%CO2,37℃孵育箱。3、MTT法检测乳腺癌细胞增殖情况。乳腺癌细胞种植于96孔板中。孵育24小时后,加入AMSCs上清液培养24-72小时,AMSCs上清液与普通培养基比例为1：1。按条件培养后,移除培养液加入50μl MTT2mg/ml溶液孵育2小时。终止培养,加入100μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10mins,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值。实验至少重复3次。4、细胞迁移实验采用Transwell小室法。AMSCs种植于PVDF膜上层培养,乳腺癌细胞置于下层,5%CO2,37℃培养箱内培养。48小时后,用棉签拭去未穿过的AMSCs,甲醛固定,结晶紫染色,显微镜下观察,拍照。5、AMSCs及乳腺癌细胞分泌的IGF-1检测。细胞培养48小时后,上清液离心,-80℃保存待测。应用Elisa酶联免疫吸附实验试剂盒检测IGF-1的分泌情况。6、克隆形成实验、DNA损伤修复检测实验来观察乳腺癌细胞对电离辐射的抵抗情况。细胞经消化制成单细胞悬液后,按照预定数量接种于6孔板中,设0,2,4,6,8五个剂量组,每个剂量组三个复孔。照射后将细胞置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内继续培养12-14天,期间根据培养液pH值变化适时更换新鲜培养液。当培养板孔中出现肉眼可见克隆时,终止培养,弃去培养液,PBS清洗细胞2遍,甲醇固定,1%结晶紫乙醇溶液染色,显微镜下计数含50个细胞以上的克隆数,计算克隆形成率和存活分数,并运用GraphPad Prism5.0软件进行多靶单击模型曲线拟合,并计算辐射增敏因子SER10。DNA损伤修复检测是通过荧光显微镜观察计数γ-H2AX点,来反映乳腺癌细胞的辐射抵抗情况。7、Western blotting法检测辐射前后AMSCs以及乳腺癌细胞IGF-1R的表达情况。处理后的细胞提取总蛋白,按照BCA法测定蛋白浓度,加入5×SDS-PAGE loading Buffer进行蛋白变性,然后经电泳、转膜、封闭后,孵育一抗和二抗,最后采用ECL法在显影仪上进行显影。8、AMSCs和乳腺癌细胞混合悬液移植于BALB/c-nu/nu、鼠皮下,分为四组：空白对照组,AMSCs组,辐射组和辐射加AMSCs组,每组5只。测量肿瘤的体积,绘制生长曲线。生长延缓分析来评价肿瘤的辐射抵抗。通过免疫组化法评价肿瘤内IGF-1R的表达情况。9、所有的结果至少重复3次。实验数据应用SPSS13.0软件分析,实验数据采用均数±标准差表示,两样本的均数比较采用两样本独立样本t检验(Independent-Sample T Test)、两组以上的均数比较采用完全随机设计资料的方差分析(one-way ANOVA)进行统计分析,析因分析采用Two-way ANOVA. P<0.05为有统计学意义。结果1、通过临床标本获得脂肪组织分离培养AMSCs,所获细胞具有长梭形、多边形的形态学特征,细胞培养可以形成细胞集落。通过体外诱导可以分化成脂肪细胞、成骨细胞。细胞具有间充质干细胞特性。两种来源所分离血管碎片细胞相比较,乳腺癌患者来源的低于肥胖患者的收获率,t=-17.725,P<0.001,具有统计学意义。在原代细胞接种于培养瓶后,24小时后贴壁细胞的贴壁收获率,乳腺癌患者来源的原代细胞贴壁收获率低于肥胖患者的原代细胞贴壁收获率,经统计学分析,两组比较均为t=15.357,P<0.001,具有统计学意义。2、AMSCs上清液促进了乳腺癌细胞的增殖。MCF-7和BT474在有AMSCs上清液培养的情况下增殖的速度要高于对照组,通过析因分析,BT474和MCF-7两组乳腺癌细胞主效应统计量分别为F=53.636, F=50.164, P值均小于0.05,说明组别与时间之间存在交互效应,随着时间的变化,上清液组与普通培养基组的增殖变化有统计学差异,AMSCs上清液促进了两组乳腺癌细胞的增殖。3、乳腺癌细胞促进了AMSCs的趋化,对其有趋化迁移作用。transwell实验检测乳腺癌细胞MCF-7对AMSCs迁移趋化能力的影响。采用One-Way ANOVA进行统计分析,F=218.491, P<0.001,说明组间有统计学差异,具有统计学意义。组间比较,结果显示,单纯培养基培养的AMSCs穿过PVDF膜的细胞较少。AMSCs与MCF-7共培养的AMSCs穿过率显著高于对照组。AMSCs与MCF-7共培养经过辐射处理后,AMSCs穿过的细胞与其他组比较更显著增高。4、AMSCs上清液促进了乳腺癌细胞的辐射抵抗。克隆形成生存分析,经过不同剂量辐射处理之后,处理组MFC-7和BT474的存活分数有所增高,放射增敏比SER10分别为0.802和0.756。免疫荧光实验,两种乳腺癌细胞经过电离辐射后,和未加AMSCs上清液培养的乳腺癌细胞相比,两组加上清液培养的乳腺癌细胞γ-H2AX损伤点明显减少,统计学分析,差异具有统计学意义(BT474：t=13.50, p<0.001; MCF-7:t=11.88, p<0.001,5、AMSCs来源的IGF-1与乳腺癌细胞的辐射抵抗相关。AMSCs可以分泌IGF-1,而且经过电离辐射后随着时间的增加,分泌IGF-1的量也在增加(F=87.069, p<0.001)。MCF-7和BT474细胞可以分泌IGF-1,但是分泌量非常少,和AMSCs相比,采用One-Way ANOVA进行统计分析,差异具有统计学意义(F=382.431, p<0.001)。Western blot结果显示,AMSCs IGF-1R的表达水平相对较低,两种乳腺癌细胞MCF-7和BT474IGF-1R的表达水平较高。克隆形成存活实验来验证,用IGF-1R阻断剂抑制AG1024阻断,观察阻断前后的变化。两组乳腺癌细胞MCF-7和BT474得出结果相类似。阻断前后比较,medium组以及medium+RT组存活分数没有统计学差异(p>0.05); IGF-1组、GF-1+RT组、AMSCs上清液组与AMSCs上清液+RT组存活分数阻断前后统计学分析,差异具有统计学意义(p<0.05)。电离辐射后,IGF-1组和AMSCs上清液组与medium组相比,具有统计学差异(p<0.05),前二者存活分数显著增高,但是这种优势可以被IGF-1R阻断剂AG1024阻断。6、体内实验AMSCs促进了乳腺癌细胞的辐射抵抗。通过对生长曲线析因分析,辐射因素与组别间存在交互作用P=0.043; FRT.FRT*天数=25.743, P<0.001; F分组*天数, P=0.004)。单独效应进行比较,对照组辐射前后随时间的变化比较,各天数点P值均小于0.05,具有统计学意义,干细胞组辐射前后随时间的变化比较结果与对照组类似。辐射前各时间点各组比较,P值均大于0.05；辐射后两组比较,0、5天没有统计学意义(F=0.092,1.278; P=0.763,0.262),10、15、20、25天有统计学意义(F=14.478,19.308,20.588,23.424；P值均小于0.001)。无辐射各组各时间点间比较,对照组与干细胞组均具有统计学意义(F=24.328,31.209；P值均小于0.001)；辐射后各组各时间点间比较,对照组与干细胞组均具有统计学意义(F=11.142,24.497；P值均小于0.001)(图3-4A,表3-5A、B)。通过以上分析,AMSCs与电离辐射之间存在拮抗作用,说明AMSCs降低了乳腺癌对辐射的敏感性,促进了乳腺癌对辐射的抵抗。射线照射后,生长延缓分析表明,干细胞组延缓时间明显短于单纯乳腺癌细胞组,统计学分析,t=3.753,P=0.006,两组之间有统计学差异。(图3-4B,表3-6)免疫组织化学法,研究了移植瘤内IGF-1R的水平。电离辐射前两组比较,AMSCs和MCF-7混合移植组IGF-1R的表达水平显著高于单纯MCF-7移植组；电离辐射后两组相比,AMSCs和MCF-7混合移植组的IGF-1R的表达水平也比MCF-7移植组高。但是,电离辐射前后比较,单纯MCF-7移植组以及AMSCs和MCF-7混合移植组IGF-1R的表达水平显著降低。结论1,本实验所获得AMSCs具有多向分化能力,经免疫表型鉴定分析,显示符合间充质干细胞的特征。2,乳腺癌患者与肥胖患者的脂肪组织相比,乳腺癌患者组织来源AMSCs收获率降低,但是获得的AMSCs在形态、多向分化性质、增殖能力和表面标志等方面没有统计学差异。3, AMSCs可以促进乳腺癌细胞的增殖,降低乳腺癌细胞对电离辐射的敏感性,增强了乳腺癌细胞的辐射抵抗。4,通过体内外实验证明,AMSCs可以通过其分泌IGF-1降低了乳腺癌细胞对电离辐射的敏感性,促进乳腺癌细胞对电离辐射的抵抗。