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毕赤酵母(Pichia Pastoris)是重要的异源蛋白分泌表达宿主,需要由N-端信号肽介导外源蛋白的分泌。内源信号肽存在于毕赤酵母自身的分泌蛋白中,可被更好地被加工,可能表现出更高的分泌效率。头孢菌素C (CPC)酰化酶是一步酶法合成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的关键酶,具有很好的应用前景。为了获得可用于毕赤酵母分泌表达的有效信号肽序列,本课题采用生物信息学方法筛选毕赤酵母内源信号肽,通过酵母增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与p-半乳糖苷酶(β-gal)的分泌表达,考察内源信号肽的分泌表达效果,并利用它们实现CPC酰化酶的分泌表达。利用SignalP4.1软件,从毕赤酵母分泌蛋白组中筛选得到具有分泌潜力的4个内源分泌信号序列：DAN4、GAS1’、MSB2与FRE2。以广泛应用的酿酒酵母α-交配因子(α-MF)信号肽以及文献报道的内源信号肽DSE4为对照,考察4个信号肽的分泌表达效果。利用突变的组成型强启动子PGI调控外源蛋白表达,构建含不同信号肽的外源蛋白表达载体和重组菌。所用CPC酰化酶(SECA)基因是对来自Pseudomonas sp. Strain SE83的高活性CPC酰化酶基因进行密码子优化后人工合成所得。经培养条件初步优化后,在摇瓶中检测EGFP、β-gal和SECA的胞内外表达水平。结果显示,MSB2介导三种蛋白的分泌效果均优于a-MF与DSE4。DAN4有利于β-gal与SECA的分泌,但对EGFP的分泌效果较差。GAS1’对β-gal的分泌效果最好,但不利于EGFP与SECA的分泌。FRE2对EGFP与β-gal的分泌效果尚可,但是不及对照DSE4,且对SECA的分泌效果最差。综合三种蛋白的分泌情况,可认为MSB2信号肽介导异源蛋白的分泌效果最好,其对EGFP、β-gal与SECA的分泌水平分别为a-MF的1.50、7.97和1.94倍。对于SECA的分泌表达,DAN4介导的分泌效果最好,分泌水平可达a-MF和DSE4的3.81和2.65倍。获得分泌表达SECA的单拷贝菌株后,提高Zeocin浓度筛选得到高抗性菌株G/MSBCAm,可进一步提高分泌表达水平,胞内外酶活分别比低抗性菌株G/MSBCA提高28.4%和53.2%。