【研究背景】颌面部骨组织的缺损通常都由外伤、肿瘤或是先天性疾病造成。骨再生是骨缺损修复的重要手段和发展方向。目前临床多采用自体骨移植或者诱导骨组织再生(guided bone regeneration,GBR)的方法来修复颌面部骨组织的缺损。但自体骨移植供体有限,且容易发生缺血坏死,而GBR技术仅局限于少量骨组织的再生,远不能满足临床治疗需求。同时这两种治疗技术可能会引起炎症反应而导致移植物吸收移植失败。近年来干细胞技术成为骨再生的研究热点。从发现骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)到成功地在动物模型中生成骨组织,研究者们对BMSCs的研究不断的取得进展。基于此,研究人员又探索开发出新的干细胞,如脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSC),牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)等等,大大提升了组织再生的效果。而在软骨内成骨的过程中,参与的干细胞聚集并形成软骨导板,并在此基础上发生细胞的肥大化、血管化进而矿化、骨化。成软骨细胞分化的干细胞分泌成血管因子和相关趋化因子并募集宿主的细胞参与软骨导板的矿化和血管化的骨重建。大量软骨组织工程研究证实,骨髓间充质干细胞来源的成软骨细胞聚集成细胞簇后增强了其软骨形成的能力。在细胞之间的相互连接和细胞与基质之间的相互作用调节下,BMSCs来源的成软骨细胞的重塑能力因为外源性的生长因子的参与而较单纯的支架干细胞移植加强了。目前已有的研究中为了实现骨缺损修复通常都是采用羟基磷灰石、三磷酸三钙等生物陶瓷来充当骨替代品,但这些人工合成的生物材料在人体内降解速率很低,与宿主本身的骨组织的融合情况也不佳,而且很容易引起炎症反应导致移植失败,而患者也为此要承受多次手术的创伤。因此开发一种微创的、低免疫排斥的以及可以很好的塑型的骨替代品是目前很值得期待的治疗方法。颗粒化的脱细胞软骨基质(particulate decellularized cartilage matrices,PDCM)支架,本身来源于有机体,取材丰富,在去除细胞后保留了原有的细胞外基质及基质内含有的生长因子,极其有利于组织的再生。此外去除细胞后,多孔状的三维结构有利于细胞和生长因子的附着,便于后期血管的长入,为骨再生过程中的血管化提供了很好的空间结构。其本身因为保留了细胞外基质而使支架具有了一定的机械强度。作为组织工程三要素之一的生长因子也是必不可少的。当前的研究中应用较多的是骨成型蛋白(bone morphology protein,BMP)。该蛋白表现出较好的促成骨和成软骨能力,但由于提取及提纯成本高,大大增加了临床应用的成本。水凝胶虽然保留了一定的化学和机械性能,但与干细胞共同植入体内后的效果仍然差强人意,不时伴有炎症反应,中央坏死等。富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)中富含600多种生长因子,这些生长因子可以大大促进血管生成以及骨重建。而且PRP可以从自体提取,不仅保证了来源更降低了应用的免疫排斥反应,因而逐渐成为近年来骨再生研究中的“明星因子”。因此本实验提出利用成软骨诱导的BMSCs细胞膜片碎化再复合PDCM和PRP成为可注射性的凝胶状混合物通过软骨内成骨的过程实现骨再生。这项技术不仅使实验操作更为简便,减少了对动物的创伤,更为以后临床转化为微创操作提供可能,为骨的再生提供一种全新方法。【目的】探讨应用经成软骨诱导的BMSCs膜片碎块(bone marrow stem cells bricks,CB)与PDCM以及PRP复合通过软骨内成骨构建可注射性组织工程骨的可行性。【方法】1.BMSCs细胞膜片的培养及鉴定:全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs成膜片并进行成软骨诱导,剪碎。对培养好的细胞膜片分别进行电镜扫描(scanning electron microscope,SEM),番红O染色,实时定量逆转录聚合链式反应(real time reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测其成软骨和肥大相关基因表达。2.PDCM支架制备及鉴定:剪取新鲜兔耳,粉碎后,1%十二烷基硫酸(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide,SDS)化学方法脱细胞。对PDCM分别进行扫描电镜观察,苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE),番红O染色,二型胶原免疫组织化学染色,以及胶原总量(COL,collagen)和糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG)总量的定量检测。3.PRP制备:取新鲜兔耳动脉血两次离心制备PRP。4.裸鼠皮下移植实验:将BMSCs膜片碎块与制备好的PDCM和PRP混合均匀,注射到裸鼠背部皮下。对照组裸鼠皮下注射PDCM和PRP混合物。分别在植入4周,12周时取材,对样本进行湿重、体积、厚度等大体观察以及组织学染色等方法评价。5.兔子胫骨头种植体周围骨缺损模型修复:将来自同只兔子骨髓培养的BMSCs经成软骨诱导后成膜并剪碎与PDCM和PRP混合注射到新西兰大白兔胫骨上种植体周围骨缺损中,以PDCM和PRP混合物为对照组,12周后取材,进行Micro-CT、组织学等检测。6.采用SPSS20.0统计软件对实验中的相关数据进行方差分析或者是随机分组的两组间均值t的检验。【结果】1.BMSCs成乳白色膜片,可用器械夹持,具有一定的厚度,SEM镜下和番红O染色结果显示BMSCs膜片有多层细胞和丰富的细胞外基质沉积,并通过细胞外基质相互交联,RT-PCR结果显示BMSCs初步肥大化并表达了相关基因如COL-I、COL-X以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等。2.HE和番红O染色结果显示PDCM经过脱细胞后除去了细胞只剩余细胞外基质构成的多孔结构,胶原和糖胺多糖的定量检测结果显示,PDCM保留了大量的胶原和糖胺多糖,体视显微镜和扫描电镜下PDCM直径200μm左右,可使其顺利通过16G注射器针头。3.裸鼠皮下实验证实颗粒化的脱细胞软骨-BMSCs细胞膜片碎块-富血小板血浆(particulate decellularized cartilage matrices-BMSCs bricks-platelet rich plasma,PDCM-CB-P)复合物可以实现早期(4周)快速血管化,CD-31荧光染色中可见大量血管样结构,同时COL-I和COL-X等软骨内成骨的胶原逐渐增多,天狼星红染色显示,新生成的COL-I和COL-X在不断的增多,并在12周时HE和马松三染色都显示生成了了大量的类骨质基质和骨组织,而对照组则在4周时血管化很差,CD-31荧光染色中几乎看不到内皮细胞的标记,在12周时HE和马松三染色中也未见明显成骨,且免疫组化染色结果显示COL-I和COL-X低表达。4.兔子胫骨头种植体周围骨缺损修复实验证实,注射的PDCM-CB-P复合物经过体内12周的时间后其中的PDCM比对照组PDCM-P中的PDCM更快的被骨组织所代替。Micro-CT结果显示PDCM-CB-P组比PDCM-P组在种植体周围生成了更多的骨组织,同样的苦味酸-酸性品红染色(vangieson,VG)也显示PDCM-CB-P组在种植体周围形成了更多的骨组织并结合更紧密,而HE和马松三染色则可见PDCM-CB-P组种植体周围有较多松质骨生成,几乎未见PDCM,而PDCM-P组则生成了较少的松质骨同时仍然可见较多的PDCM。【结论】1.成软骨诱导后的BMSCs细胞膜片、PDCM以及PRP的复合物可注射并很好地维持了注射后包块的形貌和体积,具有很好的支撑性。2.PDCM-CB-P复合物实现了早期快速血管化并很好的实现成骨。3.PDCM-CB-P复合物实现了种植体周围缺损快速的较好的软骨内成骨,为种植体周围骨缺损修复提供了新的临床治疗方法。