猪链球菌（Streptococcus suis）是导致猪和人感染败血症、脑膜炎等多种疾病,甚至死亡的主要动物源性病原体之一。它也是重要的人畜共患病病原,其传播对公众健康造成较大威胁,并对全世界养猪业造成严重的经济损失。根据其荚膜多糖（CPS）的抗原性差异,将SS分为33个血清型（1-31、33和1/2）。其中,血清型2型菌株（SS2）在世界范围内的发病率最高,致病力最强。迄今为止,已发现超过100种假定的毒力因子与SS2毒力相关,至少有37种被称为“关键”毒力因子。尽管如此,目前对SS2感染的致病机制仍然不太清楚。在蛋白质调控机制中,蛋白酶通过清除调节蛋白以及错误折叠和损坏的蛋白质来帮助细胞维持内环境平衡。研究表明,在众多不同种类的细菌中均含有四种不同类型的ATP依赖性蛋白酶,包括Clp蛋白酶（ClpAP、ClpBP、ClpXP和ClpP）、单链AAA（FtsH）、ClpYQ（也称为HsIUV）和Lon家族蛋白酶（Lon）。本文研究了ClpX、ClpP和FtsH三种ATP依赖性蛋白酶对SS2的应激耐受性与致病性的作用。1 ClpP对猪链球菌2型菌应激耐受及致病机理中作用猪链球菌可感染人和猪并造成严重的经济损失,已经受到越来越多的关注,但其发病机制仍不清楚。ClpP是ATP依赖性的酪蛋白水解蛋白酶Clp家族中的一员,它在细菌适应多种环境应激中发挥重要作用。本研究以猪链球菌2型强毒菌株ZY05719为亲本株构建clpP基因缺失株（ΔclpP）及其互补株。结果显示,与野生株相比,缺失株的链长、生长聚集倾向以及在酸性pH和的氧化应激（H2O2诱导）下生长特性等表型均发生了明显的改变。除发现clpP缺失株适应力显著下降外,缺失株ΔclpP在42℃下的生长能力显著弱于野生株,表明ClpP具抗热应激效应。体外抗吞噬与细胞黏附试验表明ΔclpP对RAW264.7巨噬细胞的抗吞噬能力下降25%,且对HEp-2细胞的黏附能力下降43.5%。小鼠感染试验表明clpP基因缺失可显著减弱细菌在小鼠体内的定殖能力并减轻临床症状和降低死亡率,而互补株可使这些毒力表型全部恢复。此外,研究发现clpP的缺失导致tpx和apuA等基因的表达显着降低,这表明ClpP可能通过调节下游应答基因而促进细菌对各种环境应激的耐受性。综上所述,ClpP在猪链球菌2型的应激耐受中起重要作用,并与致病力相关。2 ClpX对猪链球菌2型应激耐受和毒力作用的功能研究以猪链球菌2型强毒株ZY05719为亲本株构建clpX基因缺失株及其互补菌株。结果显示,与野生株相比,ΔclpX菌株的长链形成能力增强,在液体培养基中更易聚集,而在酸性pH和H2O2诱导的氧化应激下生长能力下降,并与冷应激相关。抗吞噬试验表明ΔclpX对RAW264.7巨噬细胞的抗吞噬能力显著下降。小鼠感染试验证实,ΔclpX菌株毒力显著下降,可减轻临床症状和降低死亡率。缺失株在血液、脾、肝和脑的细菌载量明显下降,互补株可恢复毒力相关表型。此外,研究发现clpX的缺失可显著降低其下游的sodA和tpx等基因的表达,这表明ClpX可以调节这些基因作为下游反应因子,以促进细菌对不同环境压力的耐受。综上所述,ClpX与SS2毒力相关,并在应激耐受中起着重要作用。3丝状温度敏感性H蛋白（FtsH）对SS2存活的作用FtsH是一种膜结合的ATP依赖性金属蛋白酶,与细菌的多种应激相关。本研究构建猪链球菌2型强毒株ZY05719的ftsH基因缺失株和互补菌株。多种应激试验结果表明ftsH缺失株对高热、渗透压、酸和H2O2的耐受性显著下降。与野生株相比,缺失株对RAW264.7巨噬细胞的抗吞噬能力下降57%,对HEp-2细胞的粘附率下降了 31.3%,且生物被膜形成能力减弱。动物试验证实ΔftsH对斑马鱼和小鼠的毒力明显下降。结果表明FtsH与猪链球菌2型的多种应激抗性相关,并影响该菌的毒力。4 CtsR对clpP基因的调节机制应激蛋白在细菌致病性过程中起着重要作用,但革兰阳性菌应激反应的调控机制尚不清楚。本研究构建了 SS2强毒株ZY05719的ctsR缺失突变株及其互补株。研究表明在BALB/C小鼠和斑马鱼感染模型中,ΔctsR的致病性均显著降低。ΔctsR中clpP的转录明显上调,表明clpP受CtsR蛋白的调控。用重组CtsR和clpP启动子进行EMSA分析表明CtsR纯化蛋白能与clpP的调控区特异性结合,证实了 CtsR可直接调控的clpP表达。