背景:Ⅱ型糖尿病是一类由于胰岛素分泌相对不足或胰岛素功能抵抗而引发的血糖异常升高的代谢性疾病,服用降糖药是控制血糖的主要方式之一。第二代磺酰脲类降糖药(sulfonylureas,SUs)是目前应用最早、品种最多、临床应用最广泛的口服降糖药。由于患者在患糖尿病的同时往往伴有肥胖、高血脂等其他疾病的发生,临床上常与他汀类药物联合使用以控制病情,这无疑增加了药物发生相互作用的风险。引起药物相互作用的原因有很多,其中基于转运体介导的相互作用是其重要机制之一。因此,研究第二代磺酰脲类降糖药与肝脏转运体OATP1B1、OATP1B3之间的关联性及其与他汀类药物间可能发生的药物相互作用机制对临床合理用药有着重要的科学意义。目的:通过构建稳定高表达OATP1B1、OATP1B3的HEK293T细胞模型,研究五种常见第二代磺酰脲类降糖药(格列本脲、格列齐特、格列美脲、格列吡嗪、格列喹酮)经转运体转运的药代动力学特征,初步推断其与OATP1B1、OATP1B3之间的关联性。分别加入OATP1B1、OATP1B3的抑制剂,观察加药前后降糖药摄取量的变化,进一步确认OATP1B1、OATP1B3与第二代磺酰脲类降糖药之间的关系,并在此基础上研究其与他汀类调血脂药瑞舒伐他汀之间的相互作用及其机制,为临床合理用药提供理论基础。方法:1.建立可以同时测定五种SUs的LC-MS检测方法,采用乙酸乙酯萃取法处理细胞样品,检测细胞破碎液中降糖药的浓度。2.用丁酸钠作用于OATP1B1-HEK293T、OATP1B3-HEK293T细胞,诱导OATP1B1与OATP1B3基因的高表达,并通过瑞舒伐他汀摄取实验验证诱导模型是否成功。3.探究五种SUs对HEK293T细胞毒性,在此基础上分别研究五种SUs在OATP1B1-HEK293T、OATP1B3-HEK293T细胞中的转运及其动力学特征,计算Km、Vmax等动力学参数,并将其与阳性对照药瑞舒伐他汀比较,初步推断这五种SUs与转运体OATP1B1、OATP1B3的关联性;分别选取其中经OATP1B1、OATP1B3介导转运的SUs,比较加用OATP1B1抑制剂四溴酚酞磺酸钠、利福平和OATP1B3抑制剂甘草酸、利福平后SUs摄取量的变化,进一步深入阐明SUs的转运机制。4.选用他汀类调血脂药瑞舒伐他汀,将其与SUs联用,比较联合用药与单独用药时细胞内药物浓度的变化,进一步确认SUs与他汀类调血脂药之间可能的药物相互作用机制。结果:1.建立的LC-MS检测方法专属性好,灵敏度较高,精密度与准确度均符合相关规定。2.OATP1B1-HEK293T、OATP1B3-HEK293T细胞经丁酸钠诱导后,其对各自相应底物瑞舒伐他汀的摄取量明显增加,表明诱导模型构建成功。3.OATP1B1-HEK293T细胞对格列齐特、格列美脲有明显的摄取,其Km、Vmax分别为30.18μΜ、12.91nmol.min-1.mg-1 protein和10.02μΜ、61.71nmol.min-1.mg-1protein,而OATP1B1底物瑞舒伐他汀的Km、Vmax分别为34.54μΜ、16.68nmol.min-1.mg-1 protein。OATP1B1抑制剂四溴酚酞磺酸钠、利福平能抑制格列齐特、格列美脲的摄取,IC50值分别为313.05μΜ、466.82μΜ和852.25μΜ、3.94m M。另外,格列齐特、格列美脲与OATP1B1底物瑞舒伐他汀之间存在一定程度相互作用:当底物为瑞舒伐他汀时,格列齐特、格列美脲明显抑制其转运(IC50为146.70μΜ和76.25μΜ);反之,瑞舒伐他汀亦会对格列齐特、格列美脲产生一定程度抑制作用(IC50分别为222.36μΜ和517.35μΜ)。4.OATP1B3-HEK293T细胞对格列本脲、格列吡嗪有明显的摄取,其Km、Vmax分别为15.36μΜ、120.00nmol.min-1.mg-1 protein和41.29μΜ、41.98nmol.min-1.mg-1protein。而OATP1B3-HEK293T细胞摄取瑞舒伐他汀的Km、Vmax为35.21μΜ、16.67nmol.min-1.mg-1 protein。加入OATP1B3抑制剂甘草酸、利福平后,格列本脲、格列吡嗪的摄取受到抑制,IC50值分别为262.63μΜ、53.51μΜ和123.90μΜ、50.08μΜ。另外,当以瑞舒伐他汀为底物时,格列本脲、格列吡嗪摄取被抑制(IC50分别为99.94μΜ和898.90μΜ);同样,当底物为格列本脲、格列吡嗪时,瑞舒伐他汀亦抑制其摄取(IC50为1.52m M和189.76μΜ)。结论:1.本实验建立的LC-MS检测方法简便灵敏,可用同时检测五种常见第二代磺酰脲类降糖药的浓度。2.格列齐特、格列美脲是OATP1B1的底物。其中,格列美脲结合OATP1B1能力强于OATP1B1底物瑞舒伐他汀,格列齐特与OATP1B1的结合能力和瑞舒伐他汀相当。OATP1B1抑制剂四溴酚酞磺酸钠、利福平对格列齐特、格列美脲的摄取有抑制作用。当格列齐特、格列美脲分别与他汀类调血脂药瑞舒伐他汀合用时,它们之间可能会发生竞争性抑制。3.格列本脲、格列吡嗪是OATP1B3的底物。其中,格列吡嗪结合OATP1B3的能力略强于OATP1B3底物瑞舒伐他汀,格列本脲与OATP1B3的结合力相对更强。OATP1B3抑制剂利福平对二者的摄取均表现出较强的抑制作用,而抑制剂甘草酸的抑制作用则相对较弱。当格列本脲、格列吡嗪分别与他汀类调血脂药瑞舒伐他汀合用时可能会发生与OATP1B3有关的竞争性抑制。4.格列喹酮不是OATP1B1、OATP1B3的底物,其肝脏转运可能与OATP1B1、OATP1B3介导无关。