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目的:利用人工合成的AT1受体细胞外第二环肽段免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,提纯并对其生物学活性进行鉴定。以期了解抗AT1受体自身抗体在动脉粥样硬化发病机制中的作用,从自身免疫角度对该病的诊治提供指导。方法及结果:根据人AT1受体细胞外第二环肽段氨基酸序列,人工合成多肽,用化学方法与载体牛血清白蛋白(BSA)偶联,免疫新西兰大白兔, ELISA法检测抗体滴度,合成的肽段有良好的免疫原性,在接受第二次免疫后一周兔体内抗体开始升高,第五次免疫后一周ELISA检测抗体反应效价达到峰值1:409 600,收获兔抗血清。免疫亲和层析法提纯抗血清,SDS-PAGE法鉴定纯化后抗体的纯度呈单一清晰蛋白带;Western blot方法检测结果显示,制备的抗AT1受体抗体与AT1受体蛋白在分子量40KD处结合,形成唯一显色带,与AT1受体蛋白分子量一致;细胞免疫荧光法检测观察到制备的抗体在细胞膜表面与AT1受体结合,与AT1受体是膜受体的细胞定位结果一致。结论:所制备的兔抗人多克隆抗体可特异性识别AT1受体,为后续针对该抗体细胞分子水平实验研究打下良好基础。目的:研究制备的兔抗人AT1受体细胞外第二环肽段抗体(AT1-AA)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达MCP-1(单核细胞趋化因子-1)的影响及相关信号机制。从细胞蛋白、分子水平探讨AT1-AA对内皮细胞炎症因子表达的影响以明确它们在动脉粥样硬化(AS)发生发展中的地位和相互关系,以及AT1受体拮抗剂可能的抗AS作用。方法及结果:将AT1-AA与HUVECs共孵育,设不同的稀释度和孵育时间点检测MCP-1的表达,取MCP-1表达量最大的1:20稀释,与HUVECs共孵育12小时。用Western blot和PT-PCR方法检测细胞MCP-1蛋白和mRNA表达。结果显示:与抗体阴性组比较AT1-AA与HUVECs共孵育后MCP-1蛋白和mRNA表达明显增高,氯沙坦可显著抑制AT1-AA诱导的内皮细胞MCP-1表达。PDTC (吡咯二硫氨基甲酸脂)是NF-κB P65特异性抑制剂,用不同浓PDTC(5,10,20μmo l/L)预处理内皮细胞1小时后,加1:20稀释的AT1-AA作用HUVECs 12h收获细胞,用Western blot和PT-PCR方法检测细胞MCP-1和P65蛋白及mRNA表达量变化,以不加PDTC组为对照。结果显示:与对照组比较,PDTC干预组随着PDTC浓度升高,MCP-1蛋白和mRNA表达量均降低(P<0.05),P65蛋白和mRNA表达量也降低(P<0.05)。直线相关分析显示,MCP-1表达水平与PDTC浓度呈显著负相关,P65表达水平与PDTC浓度呈显著负相关,提示PDTC呈浓度依赖性下调MCP-1的表达,同时下调P65的表达。结论:AT1-AA可通过NF-κB途径,上调内皮细胞下游靶基因(炎症因子MCP-1)表达促进单核细胞粘附内皮,可能是AT1受体自身抗体参与动脉粥样硬化发生发展的机制之一。目的:通过研究AT1-AA对THP-1源性泡沫细胞表达ABCA1(ATP结合盒转运蛋白A1)的影响,从细胞蛋白、分子水平探讨AT1-AA对泡沫细胞脂质转移受体表达的影响,以期明确其在动脉粥样硬化发生发展中的地位和相互关系以及AT1受体拮抗剂可能的抗AS作用。方法及结果:将THP-1单核细胞用PMA诱导分化成贴壁的巨噬细胞,给予ox-LDL脂负荷,诱导其成为泡沫细胞细胞,显微镜下观察可见细胞形态不规则,融合,胞浆内有颗粒状物,油红O染色见细胞内大量脂滴,酶荧光化学法检测细胞内含大量胆固醇,显示构建泡沫细胞模型成功。将AT1-AA与泡沫细胞共孵育,Western blot和PT-PCR方法检测细胞ABCA1的表达mRNA和蛋白表达。结果显示:与对照组相比AT1-AA显著抑制ABCA1蛋白和mRNA的表达,血管紧张素Ⅱ组相比无显著差异,氯沙坦能显著减轻AT1-AA对ABCA1蛋白和mRNA表达的抑制作用,但表达量仍显著低于阴性对照组。结论:AT1-AA下调THP-1源性泡沫细胞表达ABCA1,阻碍细胞内胆固醇的流出,可能是AT1受体自身抗体参与动脉粥样硬化发生发展的机制之一。