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第一部分荧光素酶标记骨肉瘤细胞MG63及转移亚型细胞株的建立目的:荧光素酶标记肿瘤细胞株MG63,通过肺转移灶原代培养的方法建立MG63细胞株转移亚型细胞株MG63-1和MG63-2。方法:体外培养肿瘤细胞株MG63细胞株,荧光素酶标记细胞,通过膝关节注射肿瘤细胞建立肿瘤模型,5周左右,当荧光成像仪扫描发现肺脏广泛转移时,取肺脏转移肿瘤,原代培养得细胞株MG63-1,重复上述操作得细胞株MG63-2。结果:(1)利用BSD筛选方法成功筛选到含荧光素酶的细胞株MG63-luc(2)成功将筛选到的细胞株MG63-luc注射到4周龄裸鼠成瘤,并得到肿瘤转移细胞亚型MG63-1和MG63-2。结论:成功得到含有荧光素酶标记的细胞株MG63-luc及其转移亚型MG63-1和MG63-2,为进一步研究骨肉瘤转移打下了良好的基础。第二部分MG63转移亚型细胞株体外实验的研究目的:通过一系列的肿瘤细胞经典转移能力方法,体外体内实验比较MG63和MG63-2细胞株之间肿瘤转移能力,证实MG62-2较MG63的转移能力强。方法:绘制细胞生长曲线,划痕实验,细胞吸附实验,细胞Matrigel迁移实验,与转移相关的主要5个基因MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2和Ezrin的RT-PCR及western-blotting。结果:(1)MG63-2的生长较MG63生长缓慢,细胞的周期长。(2)MG63-2划痕实验细胞的融合较MG63慢,所需时间长。(3)细胞吸附实验证实MG63-2的细胞吸附能力较MG63强。(4)Matrigel迁移实验证实MG63-2的迁移能力较MG63强(。5)RT-PCR以及western-blotting均证实MMP2和MMP9表达降低,TIMP2和Ezrin表达增高。结论:通过绘制细胞生长曲线,划痕实验,细胞吸附实验、Matrigel迁移实验,与转移相关的主要七个基因MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2和Ezrin的RT-PCR及其western-blotting,有差异表达,证实MG63-2较MG63在体外有着较强的转移能力,为下一步研究打下坚实之基础。第三部分MG63转移亚型细胞株体内实验的研究目的:本研究旨在通过膝关节注射动物肿瘤模型观察MG63和MG63-2之间肿瘤生长及转移能力的区别。方法:将MG63细胞和MG63-2细胞株的PBS细胞悬液注射入裸鼠膝关节内。荧光素酶成像仪器观察裸鼠原位肿瘤生长情况和肺转移情况。石蜡组织切片证实MG63-2在肺部有广泛的转移灶。结果:(1)采用膝关节注射法成原位肿瘤法稳定可靠;(2)原位肿瘤的生长曲线证实MG63肿瘤组成瘤性较MG63-2生长慢。(3)荧光素酶成像仪观察结果显示MG63-2的成瘤性较强,且其肺脏内转移多而广泛,有明显的统计学意义。(4)组织学HE染色,光镜下计数肿瘤转移数量,MG63-2有较强的转移能力。结论:体内实验证实MG63-2较MG63细胞株有较强的细胞成瘤性和转移能力。第四部分IGFBP5对肿瘤生长和转移影响的体内外实验的研究目的:通过构建IGFBP5基因高表达和IGFBP5 RNA干扰腺病毒,重点研究IGFBP5在肿瘤生长其转移的作用。方法:构建IGFBP5的腺病毒载体和IGFBP5的干扰病毒,分别感染Mefs、C3H10和C2C12三类细胞株,观测ALP读数,分析研究IGFBP5对其分化的影响。病毒感染143B、MG63-P、MG63-1、MG63-2细胞株绘制生长曲线,采用matrigel迁移实验分析IGFBP5对骨肉瘤细胞株的迁移能力的影响。游标卡尺及Xenogen image成像技术分析IGFBP5高表达和低表达后,肿瘤在动物体内生长与转移情况,分析其对肿瘤生长与转移的影响,石蜡组织切片,光镜下看转移灶的情况,研究IGFBP5对肿瘤转移的影响。结果:(1)ALP读数证实IGFBP5能促进C3H10、mefs、C2C12的分化,但是抑制其增长。而对SiIGFBP5则促进增长影响分化。(2)IGFBP5能抑制骨肉瘤143B-luc、MG63、MG63-1、Mg63-2的增长,SiIGFBP5则促进其增长。(3)划痕实验、matrigel肿瘤迁移实验,证实IGFBP5抑制肿瘤的迁移能力。(4)体内肿瘤生长的测量及其成像均证实IGFBP5有促进肿瘤分化,抑制增长,抑制转移的特性。结论:IGFBP5能够一定程度的抑制骨肉瘤细胞的增长,促进其分化。其在骨肉瘤的生长和转移中有重要的抑制作用。