【摘 要】
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目的:克隆survivin启动子构建survivin启动子调控的siRNA真核表达载体,探讨survivin启动子在在肿瘤特异性基因治疗中的应用。 方法:(1)以HeLa细胞基因组DNA为模板,PCR扩增
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目的:克隆survivin启动子构建survivin启动子调控的siRNA真核表达载体,探讨survivin启动子在在肿瘤特异性基因治疗中的应用。 方法:(1)以HeLa细胞基因组DNA为模板,PCR扩增survivin启动子,回收扩增产物并插入pGEM-TEasy载体(T/Surp),测序鉴定。(2)SacⅠ和HindⅢ分别双酶切T/Surp载体和pGL3Basic,回收survivin启动子酶切片断及pGL3Basic酶切片断,连接回收产物构建携带survivin启动子pGL3Basic真核表达载体(pGL3Basic/Surp),酶切鉴定。(3)纯化pGL3Basic/Surp质粒,用脂质体法转染HeLa细胞和正常血管内皮细胞ECV304,48h后收集转染细胞与荧光素酶底物反应,检测荧光素酶活性。(4)合成两对干涉stathmin基因的siRNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHI和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体(pSilencer4.1-CMV neo-S1和pSilencer4.1-CMV neo-S2)。PCR扩增带有EcoRI和BamHI酶切位点的survivin启动子,双酶切后连接入pSilencer4.1-CMV neo-S1和pSilencer4.1-CMV neo-S2(pSilencer4.1-Surp
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