PKM1和PKM2由PKM基因经过选择性剪接产生,作为糖酵解途径中的限速酶在肿瘤发生和胚胎发育中发挥着重要作用。然而,由于缺乏合适的技术手段,两种PKM剪接异构体的具体功能还没有内源性地阐明。本研究以HCT116人结肠癌细胞和斑马鱼为研究对象,利用碱基编辑器内源性地调控细胞和斑马鱼体内的PKM剪接,基于突变型细胞和突变型斑马鱼的转录组测序分析,以及突变型细胞和突变型斑马鱼的增殖、发育生长情况,对两种PKM剪接异构体的特异性功能进行分析研究。研究结果如下:1.ABEmax-NG和BE4max可以精确地突变HCT116细胞中PKM基因的剪接位点,并且没有副产物。根据HCT116细胞内PKM基因中内含子9和内含子10的5’供体位点GT和3’受体位点AG,设计了4个靶向g RNAs。Sanger测序结果显示,目标位点突变效率为37%—93%,没有多余位点突变。2.ABEmax-NG成功地干扰内源性PKM剪接,建立了具有PKM1和PKM2特异性亚型表达的细胞模型。通过m RNA的半定量检测以及RNA-Seq实验,分析突变型细胞中PKM1和PKM2的m RNA表达情况。结果显示,E9-GT突变型细胞中PKM1完全丢失而PKM2表达增加,相对应的,在E10-GT突变型细胞中PKM2完全丢失而PKM1表达增加。其中,E9-GT表示突变9号外显子右边的GT序列,E10-GT代表突变10号外显子右边的GT序列。3.PKM亚型的特异性丢失揭示了其在细胞周期调控和细胞生长中的不同作用。通过CCK-8细胞增殖实验和RNA-Seq实验分析发现,与野生型细胞相比,E9-GT突变型细胞中PKM1的丢失和PKM2的增加促进了肿瘤细胞生长,细胞周期相关基因明显上调;而E10-GT突变型细胞中PKM2的丢失和PKM1的增加抑制了肿瘤细胞的生长,并且与细胞粘附、戊糖磷酸途径、糖酵解相关的基因表现下调。4.内源性地干扰PKM剪接产生新的剪接异构体。经过琼脂糖凝胶电泳检测及测序数据分析发现,碱基编辑器在成功调控PKM1和PKM2亚型的同时,伴随着未知剪接异构体的变化以及出现新的剪接异构体。在E9-GT突变型细胞中,有2种未知的剪接异构体增加,1种未知的剪接异构体减少。而在E10-GT突变型细胞中发现了1种新的剪接异构体,并且有5种未知的剪接异构体表现出不同程度的增减。5.构建BE4max诱导的斑马鱼体内剪接位点突变模型,成功地在体内调控pkm亚型的选择性剪接。通过对pkm突变型斑马鱼的基因型鉴定、RNA半定量检测、RNA测序分析、表型分析、以及深度测序分析发现,突变型斑马鱼的pkm表达明显降低,pkmx1相对增加,与胚胎发育相关的基因表达下调,与对照组的斑马鱼相比,突变型斑马鱼体积明显小于对照组,并且伴随着较低的脱靶效率和插入与丢失。