西尼罗病毒(West Nile virus)为黄病毒科黄病毒属成员，是一种危害严重的人畜共患病病原。该病毒通过蚊媒传播，能穿过血脑屏障侵害中枢神经系统，引发人和马的致死性脑炎。但WNV入侵神经系统引发大脑炎症的机制尚不清楚。磷酸化修饰是生物体内一种常见的翻译后修饰，参与多种生命进程，在维持、调控生命体活动中发挥重要作用。环状RNA(cirular RNA，circRNA)是RNA转录水平上一种稳定表达形式，其在脑内高度表达，参与细胞成熟分化、大脑器官发育的调控。因此，研究WNV感染宿主后的磷酸化修饰和circRNA的表达变化，对深入了解WNV诱导宿主神经炎症反应机制，发现药物新靶标，解析WNV致病机制具有重要科学意义。本研究建立了WNV感染宿主的体内、体外模型，研究了WNV感染宿主后磷酸化蛋白组学和circRNA表达谱，并对其参与WNV诱导的神经炎症反应通路进行了深入分析，具体内容如下：
　　1.WNV感染神经胶质细胞模型和小鼠模型的建立
　　以人胶质瘤细胞系U251细胞为对象，研究了WNV对该细胞的感染性及其诱导细胞炎症反应情况，发现WNV可以感染U251细胞并介导显著的炎症反应，确定了以U251细胞作为WNV磷酸化蛋白组学分析的细胞感染模型；在此基础上，利用Balb/c小鼠感染WNV，建立了小鼠脑内接种感染模型，确定了用于circRNA表达谱分析的体内感染剂量和收样时间。
　　2.WNV感染胶质细胞磷酸化蛋白组学研究
　　收集WNV感染和未感染的U251细胞，提取总蛋白，利用label-free质谱的方法，检测WNV感染胶质细胞后发生磷酸化修饰的蛋白和肽段。通过生物信息学分析，筛选得到了1657个磷酸化蛋白，其中626个磷酸化蛋白显著上调，227个显著下调。进一步对这些磷酸化蛋白进行功能分析和蛋白相互作用网络分析，找到大量可能参与调控炎症反应的磷酸化蛋白。在此基础上，从中挑选部分磷酸化蛋白，利用WesternBlot和荧光定量方法进行验证。结果表明：当敲降GSK3B、PNKP、RB1三个磷酸化蛋白表达时，可显著抑制P65的入核，阻断NF-κB通路激活，下调WNV介导的炎症反应，有效降低WNV介导的神经元凋亡，但病毒复制并不受影响。说明，GSK3B、PNKP、RB1三个磷酸化蛋白在调控WNV介导的神经炎症反应中发挥重要作用，而阻断其磷酸化则有望成为西尼罗河热的治疗靶点。
　　3.WNV感染小鼠脑部CircRNA表达谱研究
　　以20PFU/只的剂量，用4周龄Balb/c小鼠(接种同样体积DMEM的小鼠做对照)脑内接种WNV，5天后处死小鼠，取脑匀浆提取总RNA，使用高通量测序的方法对WNV感染鼠脑CircRNA和小RNA表达谱进行统计分析，发现了44个显著上调的小RNA(miRNA)，28个显著下调的miRNA，108个显著上调的环状RNA(CircRNA)以及41个显著下调的环状RNA(CircRNA)。挑选部分CircRNA和miRNA，通过qPCR对测序结果进行验证，发现测序结果与qPCR结果一致。在此基础上，通过构建CircRNA与miRNA互作网络，预测了CIRC00000997、CIRC00002274可能是参与WNV介导炎症反应的两个关键CircRNA，而microRNA-24-3P、microRNA-124-3p可能是其调控的靶miRNA。