前言：　　 家族性腺瘤性息肉病（Family adenomatous polyposis，FAP）是一种常染色体显性遗传病，以结肠和直肠腺瘤样息肉为主要临床表现，发病率为1/17000～1/5000。大多数患者在青少年时期开始发病，伴随着年龄的增长，息肉的数目会逐渐增多，体积逐渐变大，如果不加以治疗，最终几乎百分之百发生恶变，是大肠癌最主要的癌前病变。结肠腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli，APC)突变是引起FAP的最主要原因。APC基因位于5q21-22，包含15个外显子，其中第15外显子全长6577bp，是迄今为止已知人类基因中最大的外显子，APC基因编码2843个氨基酸，分子量约为310kD。APC基因是一种抑癌基因，是人类大肠上皮细胞增殖过程中起“门户看守”作用的基因，APC基因突变不仅可以引起FAP，而且与大部分散发性结直肠肿瘤相关。在经典Wnt信号通路中，APC蛋白同糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3）、轴蛋白(axisinhibition protein，AXIN)和酪蛋白激酶-1（casein kinase1，CK1）结合形成四聚体复合物介导胞质内β-连环蛋白(β-catenin)的泛素化降解，参与肿瘤的发生和发展。APC基因主要突变类型为点突变以及微小的缺失和插入，大部分APC基因突变都会导致提前形成终止密码子，进而形成截短蛋白，如果截短的APC蛋白缺失β-catenin结合区，将失去与β-catenin结合的能力，引起信号通路异常，使β-catenin在胞浆内积聚，导致其入核增多，核内β-catenin与Tcf/Lef转录因子结合从而激活Wnt下游靶基因的异常表达，进而引起肿瘤的发生。　　 随着分子生物学技术的发展及对FAP致病机制的深入了解，基因突变检测为APC基因突变携带者提供了一种快速、准确的诊断方法，对FAP的早发现、早诊断、早治疗以及预防大肠肿瘤都具有十分重要的意义。本研究中我们利用PCR和sanger测序等技术，对临床确诊的5个FAP家系患者进行了APC基因突变检测，并利用免疫组化方法对其中3个家系的先证者病理组织切片APC蛋白的表达情况进行了分析，初步探讨APC基因在FAP以及大肠肿瘤发生、发展中的作用。　　 材料方法：　　 1、实验材料　　 本实验室共收集5个FAP家系（其中家系4和家系5突变分析前期已完成），经患者及家属知情同意，分别由辽宁省肿瘤医院和中国医科大学附属第四医院提供患者外周血样以及相关病例资料，并获取了家系1、家系2和家系5先证者的病理组织切片。　　 2、实验方法　　 (1)提取患者全血基因组DNA　　 采用Universal Genomic DNA Extraction Kit(TaKaRa，Japan)提取FAP家系成员外周血基因组DNA。　　 (2) Sanger测序检测APC基因变异　　 PCR扩增先证者APC基因15个外显子及其侧翼序列，PCR产物纯化回收后送至北京博迈德科技发展有限公司进行sanger测序。　　 (3)应用PCR-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行验证分析　　 通过对人类突变数据库(HGMD)以及PubMed文献检索，对检测出的未报道变异，验证是否为多态性，设计覆盖缺失位点的引物，对患者及80名无关正常个体基因组DNA进行PCR扩增，产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和常规银染检测。　　 (4)免疫组化检测FAP家系先证者APC蛋白表达情况　　 利用免疫组化方法检测家系1、家系2和家系5先证者的病理组织切片APC蛋白表达情况，分析APC基因突变对蛋白表达的影响。　　 结果：　　 1、APC基因突变检测结果　　 家系1先证者检测到c.2016_2047del(p.Ser673Leufs*35)突变;家系2先证者检测到c.2510C＞G(p.Ser837*)突变;家系3先证者检测到c.1548G＞C(p.Lys516Asn)突变。　　 2、突变结果分析　　 经数据库检索，c.2510C＞G（p.Ser837*）、c.1548G＞C(p.Lys516Asn)为已报道突变，c.2016_2047del(p.Ser673Leufs*35)为人类突变数据库(HGMD)和PubMed文献数据库中均未报道的碱基变异，经PCR-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，在80名无关正常个体中未检测到该位点变异，排除多态性可能。　　 3、FAP家系先证者APC蛋白表达分析　　 免疫组化实验结果表明，正常粘膜中APC蛋白呈阳性表达，而3个FAP家系先证者肠粘膜组织中APC蛋白表达明显降低。　　 结论：　　 1、本研究检测出1个APC基因新突变c.2016_2047del(p.Ser673Leufs*35)和2个已知突变c.2510C＞G(p.Ser837*)，c.1548G＞C(p.Lys516Asn)，丰富了APC基因突变数据库。　　 2、由于APC基因突变，形成终止密码子，最终形成截短蛋白，导致FAP患者肠粘膜组织中APC蛋白表达显著降低。　　 小鼠去卵巢骨质疏松模型的建立以及周期素G2参与绝经后骨质疏松症发生发展的初步探讨　　 前言：　　 骨质疏松是绝经后老年女性的一种常见疾病，骨质疏松会造成患者骨量减少、骨密度以及骨强度下降，引起骨骼脆性增加，极易造成骨折，严重影响老年人的生活质量，甚至威胁生命，因此对骨质疏松的预防和治疗，已经成为世界性的卫生问题之一。　　 绝经后骨质疏松的发生发展与雌激素的缺乏密切相关，雌激素缺乏导致骨失去雌激素的调节作用，引发骨质疏松。雌激素主要通过雌激素受体途径调节骨形成以及骨吸收，影响骨代谢。雌激素与雌激素受体结合，调控相关基因转录翻译，进一步发挥相关的生物学功能，但其具体作用机制仍有待进一步研究。　　 经典的Wnt信号通路在骨细胞增殖和分化两个方面对骨形成进行调控并发挥十分重要的作用，β-catenin蛋白是其中的重要作用因子。本实验室前期工作研究发现周期素G2通过促进β-catenin经泛素化途径降解，对经典Wnt信号通路产生负性调控的作用。文献报道雌激素能够通过与周期素G2启动子结合影响RNA聚合酶Ⅱ的功能，从而调控周期素G2表达，提示周期素G2可能参与雌激素调控的包括细胞成骨分化在内的某些生物学功能。最近有报道指出，周期素G2促进细胞成脂分化，而细胞的成脂分化与成骨分化是两个相反的过程，推测周期素G2可能在雌激素缺乏引起骨质疏松的过程中发挥作用。　　 目前在对绝经后骨质疏松症的基础、临床及药学相关研究中，将实验动物去卵巢引起体内雌激素水平骤降，使骨失去雌激素的保护作用，最终引起骨质疏松是经典实验动物模型。在本研究中我们构建了小鼠去卵巢骨质疏松模型，用于研究雌激素缺乏导致骨丢失发生、发展的规律以及作用机制，并对周期素G2在雌激素缺乏介导骨质疏松中发挥的作用进行初步探讨。　　 材料与方法：　　 1、实验材料　　 18只8周龄雌性昆明小鼠（体重25～30g）。　　 2、实验方法　　 (1)构建去卵巢骨质疏松小鼠模型　　 小鼠随机分为假手术组和去卵巢组，将去卵巢组小鼠双侧卵巢切除，缝合皮肤;假手术组不切除卵巢，只切开腹部皮肤，切除部分脂肪组织并缝合皮肤。小鼠术后常规饲养三个月。　　 (2)小鼠全身骨密度测量　　 小鼠术后三个月经戊巴比妥钠麻醉，应用Norland XR36双能X射线骨密度仪测量全身骨密度，对测量结果进行统计学分析。　　 (3)小鼠体重、子宫重量系数以及股骨湿重的测定　　 分别于手术前和术后三个月测量小鼠体重;术后三个月，颈椎脱位法处死小鼠，分离小鼠子宫，称重并计算子宫重量系数;分离小鼠股骨并取出结缔组织，测量股骨湿重;对以上生理指标进行统计分析，对比去卵巢小鼠与对照小鼠的差异。　　 (4)小鼠股骨组织石蜡切片HE染色　　 取小鼠右侧股骨常规固定、脱钙、包埋和切片，HE染色方法观察股骨结构变化。　　 (5)小鼠股骨总蛋白提取　　 分离小鼠左侧股骨，去除肌肉和结缔组织，盐水冲洗骨髓腔内组织。液氮中研磨骨组织至粉末状，应用蛋白裂解液提取骨组织总蛋白并定量。　　 (6) Western Blot检测周期素G2和β-catenin的表达　　 Western Blot方法检测周期素G2和β-catenin在去卵巢和假手术对照小鼠股骨中的蛋白表达情况。　　 实验结果：　　 1、去卵巢小鼠骨密度明显下降　　 小鼠手术三个月后，应用骨密度仪测量骨密度并统计分析，对比去卵巢组与假手术组小鼠骨密度值，发现去卵巢实验组小鼠骨密度明显下降(P＜0.05)，证实小鼠去卵巢骨质疏松模型的成功建立。　　 2、去卵巢小鼠骨结构观察　　 小鼠股骨组织石蜡切片的HE染色结果显示，去卵巢小鼠骨皮质疏松，呈葱皮样改变，骨小梁断裂，骨髓腔有大量空白区域存在，表明去卵巢引起小鼠骨结构明显变化。　　 3、去卵巢小鼠的其他生理指标观察　　 术前和术后三个月分别测量小鼠体重，结果发现与假手术对照组相比，去卵巢组小鼠体重明显增加(P＜0.001);术后三个月处死小鼠分离子宫，计算子宫重量系数，结果表明去卵巢小鼠子宫重量系数明显降低(P＜0.001);术后三个月处死小鼠分离股骨组织，称重，结果显示股骨湿重没有明显差异。　　 4、周期素G2和β-catenin的表达情况　　 Western Blot检测股骨蛋白结果显示与假手术对照组相比，去卵巢组小鼠股骨蛋白中周期素G2表达升高，β-catenin表达降低。　　 结论：　　 1、通过对小鼠进行去卵巢处理，经骨密度分析和骨结构观察证明成功构建小鼠骨质疏松模型。　　 2、去卵巢小鼠股骨中周期素G2的表达上升，β-catenin表达下降，表明周期素G2与经典Wnt信号通路可能参与绝经后骨质疏松的发生发展。