日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是流行性乙型脑炎的病原体,是严重危害人畜健康的一种虫媒病毒,以三带库蚊为主要传播媒介;单克隆抗体因其只针对特定的抗原表位结构且纯度高、特异性强而成为诊断、治疗以及生物制剂的重点,进行日本乙型脑炎病毒单克隆抗体制备等研究对防制该病具有重要意义。本论文报告的是进行日本乙型脑炎病毒单克隆抗体研制的情况。1.日本乙型脑炎病毒抗原的制备与纯化利用BHK-21细胞常规增殖SA14-14-2乙脑病毒,细胞于24 h左右出现细胞病变,48-72 h细胞病变即达到80%左右,此时将接种病毒后的细胞收冻,反复冻融3次后,加入PEG6000及NaCl进行样品浓缩粗提。将初提产物经45000 r/3 h进一步纯化,试验同时设立未接种病毒的细胞组进行相同处理作为对照抗原。将纯化的样品进行PCR鉴定、SDS-PAGE,以及用核酸蛋白测定仪测定纯化后抗原蛋白含量可知:纯化后的样品能够扩增出目的条带;超速离心后的样品进行SDS-PAGE,可见多条蛋白带,说明纯化后的样品具有免疫反应原性;抗原蛋白含量为19.78 mg/mL。上述结果说明本研究成功制备了日本乙型脑炎病毒抗原,并为其单克隆抗体的制备奠定了基础。2.JEV病毒单克隆抗体的制备以纯化的JEV病毒抗原常规途径免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用自建的间接ELISA方法初步筛选后,舍去阴性孔和有一个以上细胞克隆生长的孔,选取阳性且只有一个细胞克隆的孔应用乙脑IgG检测试剂盒再检,而后选取试剂盒检测时OD₄₅₀值最高者应用有限稀释法进行4次亚克隆。结果显示:常规免疫组的融合率约34%,阳性率近1%,共获得3株能稳定分泌抗JEV病毒的杂交瘤细胞系,分别命名为JEV.1、JEV.2、JEV.3。3.JEV病毒单克隆抗体的鉴定经亚型鉴定试剂盒检测JEV.1、JEV.2、JEV.3抗体亚型均为:IgG₁,轻链为k链;间接ELISA方法检测到3株杂交瘤细胞均具有良好的传代及热稳定性,细胞培养上清效价均为10³,免疫小鼠所制备的腹水效价为10⁵,血清中的抗体效价为10⁴;相加试验证实此3株细胞系针对的是同一种抗原决定簇;特异性试验及间接免疫荧光试验证实三株单抗均具有良好的特异性;硫氰酸盐洗脱法测定各株单抗的相对亲和力分别为:JEV.1 5 mol/L、JEV.2 4 mol/L、JEV.3 5 mol/L。