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目的:扑草净(prometryn)属于三嗪类除草剂,与其它除草剂相比,其除草效果好,毒性低,单位使用面积用量小,在国内应用范围广,使用量大。已有研究证实体外扑草净暴露会诱导小鼠的胸腺、淋巴结和脾脏细胞发生凋亡和坏死。在食物如牛奶,紫菜、鱼虾和海参等水产品中都有较高含量的扑草净残留,同时在人体尿液、乳汁及血浆中也均能检测到扑草净的存在,但目前关于其对人类细胞毒性影响及其具体机制的体外研究还未见报道。肺部是环境污染物累积的主要器官之一,本研究以扑草净为研究对象,选用人非小细胞肺癌细胞(A549)和人支气管上皮样细胞(BEAS-2B)作为受试细胞,探讨扑草净对细胞活力、细胞周期和细胞凋亡的影响,并检测DNA损伤和胞内ROS的产生情况,以期最终明确扑草净的细胞毒性及相关机制。方法:研究通过显微镜观察不同浓度(0,25,50,100,200μM)扑草净暴露24h和48h后对A549和BEAS-2B细胞的生长状况和形态影响;采用MTT法检测扑草净对细胞增殖活力的影响;细胞经PI单染或AnnexinV-PI双染后使用流式细胞仪检测扑草净对细胞周期和细胞凋亡的影响;使用蛋白免疫印迹技术检测周期和DNA损伤修复等相关蛋白的表达及磷酸化水平;使用免疫荧光和彗星实验检测DNA损伤情况;细胞经DCFH-DA染色后,通过荧光显微镜观察胞内ROS的产生情况,使用流式细胞术对胞内ROS水平进行定量检测。结果:1.扑草净在100-200μM处理浓度范围内,显微镜下观察到A549细胞变圆,贴壁能力减弱,细胞数量减少;部分BEAS-2B细胞出现明显皱缩,上清液中漂浮细胞和细胞碎片增多。2.扑草净在200μM浓度下处理24小时、50-200μM浓度范围内处理48小时,能引起A549细胞相对存活率的显著降低;在100-200μM处理浓度范围内作用48小时后,BEAS-2B细胞相对存活率明显降低。3.扑草净在100-200μM处理浓度范围内作用48小时,能诱导A549细胞发生G1期细胞阻滞,p53、p27和p21蛋白表达升高,同时E2F1、CyclinD1、CDK4、CyclinE和CDK2蛋白的表达降低;并诱导BEAS-2B细胞发生S期阻滞,p53表达升高,CyclinA、CDK2 表达下调。4.扑草净处理后,A549细胞凋亡数量较少,但出现Bcl2表达减少,Bax表达升高;BEAS-2B细胞出现明显凋亡,Caspase9、Caspase3和PARP前体表达下降,且均出现明显的剪切体。5.高至200μM浓度的扑草净处理A549细胞也未引起其产生明显的ROS;在200μM浓度时,可诱导BEAS-2B细胞产生明显的ROS。6.扑草净在50-200μM处理浓度范围内,能明显诱导A549和BEAS-2B细胞DNA损伤,并出现DNA双链断裂(DSBs),剂量越高,DNA断裂程度越严重,彗星实验TDNA%率越高(P<0.05;BEAS-2B细胞2000μM浓度组加入抗氧化剂NAC预处理后,能减轻DNA损伤。7.扑草净处理后,A549和BEAS-2B细胞内H2AX均发生明显磷酸化,A549细胞γ-H2AX荧光焦点有排出主核趋势;BEAS-2B细胞核内γ-H2AX染色呈散点或团块状均匀分布。结论:1.在50-200μM处理浓度范围内,扑草净能诱导A549细胞发生DNA损伤,并引发DNA损伤等应激反应,p53、p21及p27等相关蛋白参与周期调控,细胞周期进程被阻滞在G1期,γ-H2AX参与形成微核并修复DNA损伤,而对凋亡和胞内ROS水平无明显影响。2.在100-200μM的浓度范围内,48小时的扑草净处理对BEAS-2B具有明显的损伤作用,细胞存活率下降,细胞增殖和细胞周期进程受阻,胞内ROS生成增多,诱导DNA的氧化损伤,造成DNA双链断裂,细胞凋亡率升高。相关机制研究表明p53、Bcl2和Caspase3等相关蛋白参与了扑草净诱导的细胞凋亡调控。3.环境暴露剂量下,扑草净对人细胞毒性较低,但在分子水平上仍能观察到DNA损伤和相关蛋白的改变。应减少扑草净的接触,避免造成机体的健康危害。