研究背景癫痫是神经科常见病、多发病，20～30％癫痫患者虽经过早期合理使用一线抗癫痫药物，仍不能较好的控制发作而成为难治性癫痫。难治性癫痫的发病机理尚不清楚，目前国内外研究多集中在多药耐药机制，与肿瘤患者对多种化疗药物耐药相似，诸多研究报导在难治性癫痫动物模型及癫痫患者脑组织标本中检测到P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白、谷胱甘肽S-转移酶π的过度表达；最近在对肿瘤患者耐药机制研究中发现线粒体ATP合成酶下调，推测与肿瘤耐药有关。有报道应用蛋白质组学方法分析癫痫患者脑组织，线粒体Mn—超氧化物歧化酶含量减少并活性降低；大鼠持续点燃癫痫模型脑组织蛋白质组学分析发现线粒体Rieske铁硫蛋白异常；这一方面说明线粒体在癫痫发生中的重要作用；另一方面也说明应用蛋白质组学技术在癫痫患者或动物模型可发现新的致痫蛋白。我们以亚细胞蛋白质组学为切入点，在理想的难治性癫痫动物模型中，精确分析线粒体蛋白表达的变化，以探讨其在难治性癫痫形成过程中的作用，寻找新的治疗靶点。目的通过电刺激Wistar大鼠杏仁核建立复杂部分性癫痫模型，应用苯妥英对癫痫大鼠进行药物筛选，得到难治性癫痫大鼠；通过对难治性癫痫大鼠海马线粒体蛋白质组学的研究，探讨难治性癫痫耐药的机制；研究差异表达的线粒体外膜电压依赖性阴离子通道在难治性癫痫大鼠海马中的表达，结合大鼠海马组织能量变化和超微结构改变，探讨电压依赖性阴离子通道在难治性癫痫形成中的作用；同时观察难治性癫痫大鼠情感和认知行为学改变，探讨其形成的原因。方法每日电刺激Wistar大鼠杏仁核，刺激参数：强度400μA，波宽1ms，频率60Hz，持续时间1s，观察点燃成功率，按Loscher方法应用苯妥英筛选耐药大鼠，观察脑电变化，组织形态学观察海马神经元变化；提取大鼠海马线粒体，应用二维凝胶电泳和基质辅助激光解析—飞行时间质谱技术分析PHT耐药组和PHT有效组线粒体蛋白表达差异；对于获取的差异蛋白—电压依赖性阴离子通道，应用Western Blot和免疫组织化学进行鉴定，并同时应用电镜和高效液相色谱技术对线粒体超微结构和能量情况进行检测，进一步检测神经元的受损和凋亡情况，分析电压依赖性阴离子通道蛋白与其相关性；并应用惊吓反应、旷场活动、拒俘反应性和Morris水迷宫实验探讨难治性癫痫大鼠情感、认知和行为改变。结果点燃成功率71.59％，经过4次药物筛选，耐药率26.38％；有效率23.81％；变化组为49.21％，成功建立难治性癫痫模型，点燃成功大鼠出现高波幅棘慢波发放，有自发痫性放电，耐药组海马神经元排列松散紊乱，轮廓不清；应用线粒体蛋白质组学鉴定出19个差异蛋白(P＜0.05)：顺乌头酸酶、谷氨酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、NADH脱氢酶、ATP合成酶、3—磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸丙糖-1、丙酮酸激酶同工酶类似物、ATP结合盒B亚家族、磷脂酶A2、丝氨酸蛋白酶抑制剂、热休克蛋白、解偶联蛋白、微管蛋白、醛糖A、Cofilin 1、醛脱氢酶、电压依赖性阴离子通道1、电压依赖性阴离子通道2；与PHT有效组比较，Western Blot和免疫组化结果均显示PHT耐药组电压依赖性阴离子通道1升高(P＜0.05)、电压依赖性阴离子通道2降低(P＜0.05)，超微结构显示PHT耐药组线粒体损伤(P＜0.05)，发生凋亡(P＜0.05)，ATP和能荷降低(P＜0.05)，能荷与电压依赖性阴离子通道1成负相关(P＜0.05)、与电压依赖性阴离子通道2成正相关(P＜0.05)；耐药组情感认知行为障碍较明显，有明显的惊吓反应，出现打洞、埋头、趋暗性等多种躲藏、逃避性焦虑样行为，旷场活动性减少(P＜0.05)，拒俘反应性增强(P＜0.05)，水迷宫逃避潜伏期延长(P＜0.05)，在原平台象限内游泳时间百分比和穿环次数有显著的降低(P＜0.05)。结论应用PHT筛选电刺激大鼠杏仁核成功建立难治性癫痫模型；线粒体众多蛋白表达异常，参与难治性癫痫的形成，包括三羧酸循环酶、呼吸链酶，线粒体外膜蛋白等；电压依赖性阴离子通道1和电压依赖性阴离子通道2在难治性癫痫的发生中发挥重要作用，与线粒体的损伤和能量衰竭具有相关性；难治性癫痫存在情感、认知和行为障碍，与电压依赖性阴离子通道1和电压依赖性阴离子通道2导致的线粒体损伤和能量衰竭有关。