1.背景与目的: 目前尽管过继免疫治疗对某些肿瘤如恶性黑色素瘤、肾癌等显示出一定的疗效，但在其他大部分肿瘤包括肝癌的治疗中效果不理想，其原因可能与肿瘤抗原的免疫原性较弱、缺乏共刺激因子、体外培养的效应细胞活性下降等有关。近年的研究表明，调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)对其他效应细胞的免疫抑制，也是影响过继免疫治疗效果的重要原因之一。Treg细胞来源于胸腺，也可以在外周淋巴组织中由特异性抗原或者抑制性细胞因子诱导产生，它表达CD4、CD25、FOXP3、CTLA-4、GITR等多个分子。研究发现在胃癌、乳腺癌、卵巢癌等患者外周血或者肿瘤组织中Treg数量增多，而且Treg增多提示患者的预后差。但关于Treg在肝癌外周血和组织中的水平及其对预后的影响少见有报道。 本研究将探讨肝癌患者外周血中Treg/CD4+T比例、肝癌组织中Treg分布、数量及其与临床病理特征和预后的关系，阐明Treg在肝癌临床中的意义，为进一步开展肝癌的过继免疫治疗提供参考。 2.病例和方法: 63例肝细胞性肝癌患者均于1999年1月至2000年12月在中山大学肿瘤防治中心肝胆科行根治性手术切除，治疗前均未接受任何抗肿瘤治疗和免疫治疗，没有合并免疫相关性疾病。其中男性54例(85.7﹪)，女性9例(14.3﹪)；年龄25～72岁，中位年龄53岁。58例合并有慢性乙型肝炎感染(92.1﹪)。按照UICC(2002)的分期标准，Ⅰ期15例(23.8﹪)，Ⅱ期46例(73.0﹪)，Ⅲ期2例(3.2﹪)。随访截止日期为2005年12月31日，以5年累积生存率和无瘤生存率作为观察预后的指标。同时收集研究对象的性别、年龄、术前AFP水平、ICG<,R15>、乙肝感染情况、UICC分期、肿瘤的包膜、大小、肝硬化程度、癌细胞分化程度一共10项临床病理特征的相关资料。20例慢性乙型肝炎感染者、40例健康献血者的外周血分别作为肝炎对照组和正常对照组。10例肝炎组织、10例因肝脏良性病变(肝血管瘤6例，FNH4例)行手术切除的标本周围的肝组织(病理确诊为正常肝组织)分别作为肝炎对照组和正常对照组。外周血中Treg的表面标记选择为CD4CD25双阳性，肿瘤组织中Treg的标记为FOXP3阳性。采用流式细胞术检测患者手术前2至3天外周静脉血Treg及CD4+T细胞，计算Treg比例；采用免疫组化方法检测肿瘤组织、癌旁肝组织(距离肿瘤边缘<1cm)中FOXP3的表达，在光学显微镜下观察FOXP3阳性细胞的分布特征，随机选择10个高倍视野(×400)分别计算肿瘤组织和癌旁肝组织的FOXP3阳性细胞的总数并取其平均值作为最终结果，以FOXP3+细胞数量作为组织中Treg的数量。 分别比较HCC与对照组外周血、组织中Treg细胞水平的差异。Mann-WhimeyU检验比较两组问差异；采用Spearman相关分析法分别分析外周血和肿瘤组织中Treg细胞的相关性、外周血Treg细胞比例、肿瘤组织中Treg细胞数量与各个临床病理指标的相关性，Log-rank法检验单因素对预后的影响，Cox多因素回归模型分析Treg与预后的关系，采用SPSS 10.0 for windows软件进行统计学处理，双侧P<0.05认为差异有显著性。 3.结果: 3.1 肝癌患者外周血Treg的比例63例肝癌患者外周血中Treg的比例为(12.85±4.82)﹪，20例乙肝患者为(9.21±2.09)﹪，40例正常对照组为(8.80±1.91)﹪。肝癌患者外周血中Treg的比例显著高于乙肝患者及正常对照组(P值均<0.01)；乙肝患者和正常对照组之间差异没有统计学意义(P=0.551)。 3.2肝癌组织、癌旁肝组织Treg细胞的分布情况63例肝癌组织的免疫组化结果显示：FOXP3阳性细胞主要位于肿瘤间质内，呈巢状聚集或者散在分布，在癌巢中呈散在分布。肿瘤组织Treg的数量为(2.50±2.11)/HP，变化范围为0.2～9.7/HP。在癌旁肝组织、10例肝炎组织、10例正常肝组织中均未见FOXP3阳性细胞。 3.3 肝癌外周血与组织中Treg的关系外周血Treg比例与肿瘤组织中Treg数量呈明显正相关(r=0.284，P=0.024)。 3.4 Treg细胞与临床病理特征之间的关系分析外周血Treg比例、肝癌组织中Treg细胞与患者的性别、年龄，术前AFP水平、ICG<,R15>，乙肝感染情况，UICC分期，肿瘤包膜、大小、肝硬化程度，癌细胞分化程度的关系，结果提示外周血Treg比例、肝癌组织中Treg细胞数量与各个临床病理指标无相关性(P值均大于0.05)。 3.5 Treg与预后的关系全组病例均获得随访。随访期间有43例(68.3﹪)出现肿瘤复发，36例(57.1﹪)死于肿瘤复发，全组1，3，5年累积生存率分别为93.7﹪，63.5﹪，42.9﹪。1，3，5年无瘤生存率分别为84.1﹪，42.9﹪，31.7﹪。 按照外周血Treg比例是否大于HCC组的均值(12.85﹪)，将病例分为高水平组(Treg比例>12.85﹪，n=37)、低水平组(Treg≤12.85﹪，n=26)，二组5年累积生存率分别为32.4﹪、57.7﹪，其差异有显著性意义(P=0.020)；5年无瘤生存率分别为27.0﹪、38.5﹪，其差异无显著性意义(P=0.119)。 按照每高倍视野(HP)的肿瘤组织Treg细胞数量是否大于3个，将病例分为高水平组(Treg数量>3/HP，n=20)、低水平组(Treg数量≤3/HP，n=43)，其5年累积生存率分别为25.0﹪、51.2﹪，5年无瘤生存率分别为15.0﹪、39.5﹪，其差异均有显著性意义(P值分别为0.025、0.009)。 利用Cox回归模型分析临床病理指标以及外周血Treg比例、肝癌组织中Treg数量对预后的影响。结果显示肿瘤是否有包膜、外周血Treg比例、肿瘤组织Treg数量是影响5年生存率的独立因素(P值分别为0.007、0.042、0.019)，肿瘤是否有包膜、肿瘤组织Treg数量是影响5年无瘤生存率的独立因素(P值分别为0.016、0.001)。 4.结论: 4.1肝癌患者外周血中Treg的比例显著高于乙肝患者及健康对照组；肝癌组织中存在Treg浸润的现象。 4.2外周血Treg比例与肿瘤组织中Treg数量呈明显正相关。 4.3肝癌患者外周血Treg比例、肝癌组织中Treg数量与临床病理特征无关。 4.4外周血Treg比例、肿瘤组织Treg数量是影响肝癌根治术后5年生存率的独立因素。肿瘤组织Treg数量是影响5年无瘤生存率的独立因素。