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前言肺癌是严重威胁人类生命的疾病,最新统计资料显示,在世界范围内,肺癌所引起的死亡占所有肿瘤引起的死亡的首位。尽管目前多种治疗方法,包括分子靶向治疗,但肺癌治疗的效果始终不令人满意,其五年生存率低于15%。为了提高其5年生存率,更多的治疗方法正在被探索之中。目前中医药方法治疗肺癌受到了日益的关注青藤碱(sinomenine, SIN)是抗风湿中药青风藤(Sinomeninum scutum Rehd. et Wils.)的单体提取物,其分子式为C19H23NO4,分子量329.38。青藤在中国应用于治疗风湿病已经有上千年历史。其目前在应用上主要以其盐酸盐形式为主即盐酸青藤碱为主。青藤碱具有抗炎、抗风湿、免疫抑制、镇痛、抗血管生成、抗心律失常等广泛的药理作用。新近研究报导其具有一定的抗肿瘤作用。细胞凋亡,又称程序性死亡,包括一系列生物化学事件,引起细胞发生特征性形体变化和生物化学改变。一些药物通过诱导凋亡的方式抑制恶性肿瘤的增殖。细胞凋亡主要有三种通路：一种是以Fas和TNFR为代表死亡受体信号转导途径,凋亡发生过程中伴有caspase-8的活化；第二种是以线粒体为核心的凋亡途径,Cytochrome c从线粒体释放到胞浆与APaf-1继而与Caspase-9结合,引起Caspase-9自身剪切激活,启动凋亡过程中伴有caspase-9的活化；第三种是以内质网为核心的凋亡途径,凋亡过程中伴有caspase-12的活化。目前青藤碱对肺癌细胞是否有抑制作用的研究尚未见报导。本实验研究青藤碱对非小细胞肺腺癌细胞系NCIH-460增殖和凋亡的影响,并研究其机制,为深入研究青藤碱抗肿瘤机制提供实验基础,应用于临床治疗肺癌提供理论依据。实验材料与方法一、青藤碱对肺癌细胞系NCI-H460增殖、凋亡的影响的研究采用四甲基偶氮噻蓝(MTT)法检测青藤碱对NCI-H460细胞增殖的；采用流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡；TdT酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNNEL)方法观察细胞的形态变化；采用扫描电镜观察细胞超微结构的变化。二、青藤碱诱导肺癌细胞系NCI-H460凋亡的机制的研究采用罗丹明123(Rhodamine123)染色,通过流式细胞仪检测线粒体膜电位(△Ψm)；采用分光光度法检测caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性的变化；采用Western blot方法检测SN对凋亡相关的蛋白如细胞色素C、Bcl-2、Bax的表达的影响。三、MEK／ERK和PI3K／Akt信号通路参与青藤碱诱导NCI-H460细胞凋亡的研究采用Western blot法检测SIN对NCI-H460细胞的ERK1／2、p-ERK1／2、Akt、p-Akt的表达的影响；采用流式细胞仪PI单染的方法检测信号通路阻滞剂与青藤碱联合对NCI-H460细胞凋亡的影响。结果一、青藤碱对肺癌细胞系NCI-H460增殖、凋亡的影响：随着SIN浓度的加大和作用时间的延长,其对细胞的增殖有明显的抑制作用,呈现明显的时间-剂量效应关系。SIN 240μg／ml作用72 h,其抑制率达到最大的85.89%。流式细胞AnnexinV/PI检测细胞凋亡分析表明,SIN作用48 h,随浓度的增高,早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例都逐渐增加,与对照组相比差异具有显著性(P<0.05)。SN 200μg／ml组可见凋亡细胞细胞核的棕黄色着色,并可见细胞内DNA呈片段化的改变,而对照组没有相应的变化。通过透射电镜观察,对照组NCI-H460的细胞形态规整,细胞核较大,线粒体丰富,膜相结构完整；青藤碱组凋亡细胞体积变小,胞质浓缩,胞浆内空泡增多,染色质固缩、边集或碎裂成不规则块状,线粒体肿胀。二、青藤碱诱导肺癌细胞系NCI-H460凋亡的机制：120gg／ml,200gg／ml SIN处理24 h后，结果表明caspase-3和caspase-9被活化，从而参与细胞凋亡的发生。120,200gg／ml SIN处理48 h后,处理的细胞内的△甲m峰值下降,分布在去极化区域的细胞增多,与对照组比较有显著差异(P<0.05),细胞内的△Ψm峰出现有意义的向左移的趋势。SIN(80,120,160,200μg／ml)对NCI-H460细胞作用48 h后,结果可见细胞浆内细胞色素C逐渐增多,而线粒体内细胞色素C逐渐减少,细胞色素C由胞浆释放到线粒体中。经过SIN(80,120,160,200μg／ml)处理NCI-H460细胞48 h后,Western blot方法检测结果显示,随SIN浓度的不断增加,Bax蛋白表达水平逐渐升高,而Bcl-2蛋白表达水平随浓度的增加逐渐降低,Bax/Bcl-2的比值逐渐升高。三、MEK／ERK和PI3K／Akt信号通路参与青藤碱诱导NCI-H460细胞凋亡随着SIN处理时间的逐渐延长, ERK1／2、p-ERK1／2、Akt、p-Akt表达逐渐上升。表明SIN处理可以诱导MEK／ERK以及P13K-AKT通路的活化。PD98059+SIN组、LY294002+SIN组与单纯SIN组相比,所诱导的凋亡明显升高,与之相比有明显的统计学差异(P<0.05)。结果表明MEK／ERK以及P13K／AKT通路抑制剂拮抗了其通路活化所发挥的抗凋亡作用,对青藤碱诱导的凋亡具有协同作用。结论1、青藤碱可以抑制肺癌细胞系NCI-H460的增殖,这种抑制作用具有时间和浓度依赖性。青藤碱抑制肺癌细胞系NCI-H460的增殖是通过诱导其凋亡来实现的。2、青藤碱可能通过线粒体途径诱导肺癌细胞系NCI-H460的凋亡。青藤碱可能通过调控Bcl-2家族蛋白的表达,改变线粒体膜通透性,导致Cytochrome c从线粒体释放入胞浆,从而激活线粒体途径而诱发的细胞凋亡。3、SIN处理后诱导NCI-H460细胞凋亡过程中,伴随着MEK/ERK以及P13K／Akt通路的活化。应用MEK/ERK以及P13K／Akt通路的抑制剂可以拮抗其抗凋亡作用,提高SIN所诱导的NCI-H460细胞的凋亡的效果。