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茶是21世纪的健康饮料，茶叶中含茶多酚、生物碱、氨基酸等多种生理活性成分，使茶叶具有抗氧化、抗癌等多种保健功能。咖啡碱是传统茶叶的主要生物碱，具有提神、醒脑、促进消化和抗优郁等功效，容易引起失眠等不利作用，不适合老人、小孩、孕妇及神经衰弱者饮用。南昆山毛叶茶(Camellia ptilophylla Chang)是一种天然低咖啡碱、高可可碱可供饮用的茶叶，其体内生物碱的组成由3％～6%的可可碱替代了3%～5%的咖啡碱，可避免咖啡碱引起的不良反应，但保留了传统茶叶中其他的保健功效，因此开展其生物碱合成分子机理的研究具有重要意义。
本研究以特殊生物碱代谢植物低咖啡碱、高可可碱的南昆山毛叶茶为主要研究材料，以高咖啡碱、低可可碱含量的广东省级良种英红九号为对照材料，利用本实验室已构建的这两个品种的cDNA文库，运用文库筛选和RT-PCR技术，获得咖啡碱生物合成关键基因-N-甲基转移酶基因(NMT)，研究其体外表达特性，并进行功能鉴定，以期揭示南昆山毛叶茶大量合成可可碱，而不合成咖啡碱的分子机理，为进一步从基因水平上利用反义RNA或基因沉默等技术，培育天然无咖啡碱或低咖啡碱的茶树新品种，奠定基因水平的研究基础。本论文主要研究结果如下：
(1)英红九号cDNA文库N-甲基转移酶基因(NMT)的筛选利用菌落原位杂交方法从英红九号cDNA文库中筛选获得46个阳性克隆，经序列分析和查重，得到24个不同序列的NMT基因，全部序列与已登陆的茶叶N-甲基转移酶基因序列具有90%以上的同源性，其中12个为包含完整开放阅读框的全长基因，分别命名为YH-NMT1、YH-NMT2、YH-NMT3、YH-NMT4、YH-NMT5、YH-NMT7、YH-NMT8、YH-NMT10、YH-NMT11、YH-NMT12、YH-NMT13和YH-NMT14，它们的基因全长、编码区和编码的氨基酸个数分别为1431、1110和369、1467、1110和369、1393、1068和355、1324、1068和355、1486、1110和369、1488、1110和369、1549、1110和369、1354、1068和355、1374、1119和372、1368、1005和334、1457、1098和365和1513、1098和365。
(2)南昆山毛叶茶N-甲基转移酶基因(NMT)的克隆根据从南昆山毛叶茶cDNA文库筛选的2个全长基因和RACE方法克隆的2个全长基因序列特性，设计特异引物，通过RT-PCR的方法扩增N-甲基转移酶基因，克隆得到23个具有完整开放阅读框的基因，全部序列与已登陆的N-甲基转移酶基因序列具有90%以上的同源性，分别命名为MY-NMT(0、1、3、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、22、24、25、26、28、30、31、33、34)。除MY-NMT18编码区长1116bp，编码371个氨基酸外，其余基因编码区长均为1098bp，各编码365个氨基酸。
(3)克隆NMT全长基因体外原核表达载体构建和表达条件优化以pET32a(+)为表达载体，对英红九号和南昆山毛叶茶全部35个克隆NMT基因构建原核表达载体，并转入表达宿主菌DE3(BL21和Rosseter)。通过不同诱导温度、IPTG浓度和诱导时间对靶蛋白表达特性分析，获得靶基因原核表达优化条件：30℃，1mmol/L IPTG，诱导6h。
(4)克隆NMT基因原核表达蛋白的功能鉴定克隆NMT基因原核表达蛋白经分离纯化后，分别加入不同反应底物和甲基供体SAM进行酶促反应，反应产物经HPLC检测表明：MY-NMT(3、10、14、15、18、26、30、33、34)和YH-NMT13具有催化7-甲基黄嘌呤合成3，7-二甲基黄嘌呤(可可碱)的功能；YH-NMT(4、8、10)具有催化1，7-二甲基黄嘌呤合成1，3，7-二甲基黄嘌呤(咖啡碱)的功能；YH-NMT14具有催化可可碱合成咖啡碱的功能；YHNMT(1、2、5)不仅能催化7-甲基黄嘌呤合成可可碱，还具有催化1，7-二甲基黄嘌呤合成咖啡碱的功能。
(5)基因定点突变和功能鉴定采用基因定点突变技术将MY-NMT10和MY-NMT14碱基序列691号碱基由A突变成G，使其编码的第221位氨基酸由H组氨酸变为R精氨酸，经功能鉴定表明2基因突变前/后其表达蛋白催化活性没有改变，均只具有催化7-甲基黄嘌呤合成可可碱的功能，表明其编码的第221位氨基酸并不是其活性决定位点。