水稻抗白叶枯病基因Xa7是一个显性抗病基因,具有广谱、持久、高抗的抗性,并且在水稻全生育期都保持优良的抗性。对Xa7基因的克隆,将为阐明其调控的抗病分子机理打下坚实的基础,同时通过发掘其抗病功能,能够在水稻抗病分子育种中展现出重要的应用价值。通过对Xa7的定位区间内基因组序列进行分析发现,与其他水稻品种相比存在较大差别,序列较为复杂。无法通过图位克隆的方法将Xa7基因克隆。因此本实验室前期通过对含有Xa7基因的水稻品种镇恢084进行辐射诱变,筛选到在Xa7定位区间染色体缺失106 kb片段的感病突变体,与之前120 kb的定位区间有25 kb的重叠区,由此将Xa7定位在25 kb的区间内。为了克隆Xa7基因,本研究利用构建亚克隆载体的方法对Xa7基因进行进一步克隆。通过利用1个覆盖25 kb定位区间的阳性单克隆,通过PCR的方法获得覆盖这25 kb区间的四个亚克隆片段(P1、P2、P3、P4),并将得到的片段连接到载体pCAMBIA1300上,构建了覆盖Xa7定位区间的4个亚克隆载体,然后将其转基因到感病品种中花11中。通过对转基因苗进行引物鉴定和对阳性转基因植株进行接菌PXO86验证,发现P2、P3、P4转基因阳性株系均为感病,均未互补镇恢084的抗病表型,推测Xa7基因并不在这些片段中。而在P1转基因株系中鉴定发现5株抗病植株,病斑长度与镇恢084一致。且经过背景验证及分析显示这些转基因植株背景是正确的。为了进一步分析这些抗病植株,将P1-1抗性植株繁种到T1代并进行引物鉴定和接菌PXO86验证,发现阳性株系均为抗病,并且通过接菌不同的生理小种并比较其抗谱发现和镇恢084抗谱一致。以上结果表明Xa7基因确实存在于P1亚克隆片段中。通过对P1片段分析发现其中包含3个候选基因,为了最终确定Xa7,研究同样利用P1亚克隆片段通过PCR的方法获得覆盖P1区间的四个更小的亚克隆片段(C1、C2、C3、C4),并将这些片段与载体pCAMBIA 1300连接构建成重组载体,从而构建了覆盖P1定位区间的4个更小的亚克隆载体,然后将其转基因到感病品种中花11中,目前已得到阳性克隆和转基因苗,并筛选出阳性转基因株系,并将进行大田种植和接菌验证,从而最终克隆Xa7基因。