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在植物基因工程研究中,质体是继核转化之后又一新的遗传转化和表达受体.质体转化体系具有可同时进行多基因转化;细菌的基因和很有应用价值的人类的cDNAs可以不经过密码子的修饰或重新合成而直接表达;外源基因表达水平高;后代遗传稳定;定点整合,不会产生基因沉默及母性遗传,安全性好等优点.目前,叶绿体转化已在烟草、拟南芥菜、马铃薯、番茄和油菜(Brassica napus和Lesquerella fendleri)等少数几种双子叶植物中获得了成功.而单子叶植物,仅在水稻中获得了转化植株,但叶绿体基因组没有达到同质化.小麦的叶绿体转化研究虽然有研究,但未构建定点整合表达载体,仅仅实现了瞬时表达.该实验通过分析小麦叶绿体基因组全序列(GenBank AccessionNo.AB042240),首次选定了rbcL和psaⅠ基因间隔区作为外源基因的定点整合位点.用引物1和2扩增包括rbcL基因的3端部分的约1.0kb的DNA片段,位置从基因组全序列的55744~56767,长度为1042bp,以该DNA片段作为同源重组片段1;用引物3和引物4扩增包括完整的psaⅠ和ycf4这两个基因在内的约1.5kb的DNA片段,位置从基因组全序列的56788~58284,长度为1515 bp,以该DNA片段作为同源重组片段2;以烟草叶绿体基因的启动子Prrn和终止子psbA3控制外源基因的转录;分别构建了包含gfp报告基因和分别含有筛选标记aadA、nptⅡ和betA基因的小麦叶绿体基因组定点整合表达载体pRAGY,pRNGY和pRCGY.由于叶绿体的原核性质,所构建的载体首先在大肠杆菌中检测其有效性.当用这些载体分别转化大肠杆菌后,通过激光扫描共聚焦显微镜和普通荧光显微镜均检测到了构建在表达载体中的gfp基因在大肠杆菌中表达所发出的强烈的绿色荧光,这表明构建在表达载体中的外源基因在具有原核性质的叶绿体中已实现成功表达.用基因枪轰击法将小麦叶绿体表达载体pRNGY导入小麦核生3号的愈伤组织;轰击过的材料在MB<,2>继代培养基上先恢复培养一周,然后转到添加了150mg/L巴龙霉素的MB<,2>培养基上筛选6-8周,获得抗性愈伤组织.