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子宫珠蛋白(uteroglobin,UG)是一种小分子分泌性蛋白,它主要由衬覆于远端细支气管的非纤毛上皮细胞——Clara细胞所分泌。UG具有抗氧化、抗炎、免疫调节、抑制成纤维细胞趋化以及抑制肿瘤细胞外基质侵袭等多种生物活性。UG的生物学作用有赖于子宫珠蛋白结合蛋白(uteroglobin binding protein,UGBP)的介导。国内外对UGBP的研究了解甚少,而有关UGBP基因转录调控的研究尚未见报道。本实验首先构建UGBP基因5’侧翼启动子区(-2234bp~+64bp)报告基因质粒,在此基础上观察TGF-β1对UGBP基因启动子活性的影响,初步筛选出UGBP核心启动子区,为进一步对UGBP转录调控原理的研究提供新的线索。
方法:①采用PCR法从小鼠的总DNA中扩增出UGBP基因5’侧翼启动子区(-2234bp~+64bp),经双酶切后插入到空载体pGL3-basic中,构建报告基因重组质粒。②重组质粒转染NIH3T3和HBE细胞,转染48 h后双萤光素酶检测UGBP启动子活性;③采用smad3蛋白抑制剂(SIS3)预处理,双萤光素酶检测UGBP的启动子活性。④构建不同长度UGBP启动子报告基因重组质粒,双萤光素酶检测UGBP的启动子活性。
结果:
1.测序结果显示:插入到空载体pGL3-basic中的目的片段大小、方向正确,成功构建重组质粒pGL3-UGBP-FL、A、S、903、567、321。
2.双萤光素酶检测启动子活性结果显示:UGBP启动子在HBE细胞中的活性高于NIH3T3细胞中的活性(p<0.05)。
3.重组质粒pGL3-UGBP-FL(1μg,2μg,4μg)转染NIH3T3和HBE细胞,2μg质粒组的UGBP启动子活性高于1μg组和4μg组(p<0.05;)。
4.TGF-β1(5 ng/ml)作用于HBE细胞12h、24h,双萤光素酶检测启动子活性结果显示:TGF-β1增强了UGBP的启动子活性(12 h组与报告基因组比较,p<0.05;24 h组与报告基因组相比,p<0.01;报告基因组与对照比较,p<0.01)。
5.TGF-β1(10 ng/ml)作用于NIH3T3细胞双萤光素酶检测启动子活性结果显示:TGF-β1增强了UGBP的启动子活性(p<0.01)。
6.SIS3(3μ mol/L)预处理可以减轻TGF-β1对UGBP启动子活性的影响,SIS3+TGF-β1组与TGF-β1组比较有统计学意义(P<0.05)。
7.双萤光素酶检测启动子活性结果显示:质粒pGL3-UGBP-321转染HBE细胞48 h UGBP启动子活性较强,pGL3-UGBP-321质粒组与pGL3-UGBP-FL质粒组相比较没有显著差异(P>0.05);pGL3-UGBP-321质粒组与对照组相比较有统计学差异(P<0.01)。
结论:
1.成功构建并鉴定了一系列UGBP基因5’侧翼启动子区不同长度片段萤光素酶报告基因载体——pGL3-UGBP-FL、A、S、903bp、567bp、321bp重组质粒。
2.TGF-β1可增强NIH3T3和HBE细胞中UGBP启动子的活性。
3.TGF-β1对HBE细胞中UGBP启动子活性的影响有赖于smad细胞内信号途经的介导。
4.UGBP基因转录起始位点上游-257 bp~-76 bp区域是UGBP基因的核心启动子区域。