目的建立免疫缺陷肝损伤小鼠模型,为移植研究提供平台并促进开展后续的人体生理和疾病研究。内容和方法1.通过应用CRISPR/Cas9系统建立Prkdc和IL2ry基因敲除小鼠(1)通过对小鼠的超排、取卵获得足够的受精卵为后续显微注射提供基础;(2)通过设计敲除目的基因的gRNA并通过体外转录的方法制备用于显微注射的 mRNA;(3)显微注射后将改造后受精卵移植入代孕母鼠,等待基因敲除小鼠出生;(4)对新生鼠进行基因型鉴定以及测序,确定目的基因敲除的正确性。2.通过与NOD/Scid以及Fah背景小鼠杂交获得NSG、FNSG小鼠(1)通过与NOD/Scid背景小鼠杂交获得NSG小鼠,通过基因型鉴定以及测序验证其正确性;(2)通过与Fah背景小鼠杂交获得FNSG小鼠,通过基因型鉴定以及测序验证其正确性。3.鉴定所获得转基因小鼠表型正确(1)通过流式细胞术对基因型正确的转基因小鼠的外周血,脾脏,骨髓以及胸腺进行检测;(2)通过断药(NTBC)的方式检测Fah背景小鼠以及转基因FNSG小鼠表型,通过观测记录其断药后体重变化,以及断药一定时间后的肝脏切片组织学变化。结果1.通过CRISPR/Cas9系统可以实现多基因的快速高效敲除以建立模式动物;2.通过杂交获得的Sirpa、Fah基因可稳定遗传;3.通过流式细胞术表型鉴定可以发现,Prkdc基因敲除小鼠外周血以及组织单细胞检测T、B细胞显著减少;IL2rγ基因敲除小鼠外周血以及组织单细胞检测NK细胞显著减少;Prkdc基因、IL2rγ基因均敲除的小鼠(SG)小鼠以及其与NOD/Scid背景杂交后的纯合型(NSG)小鼠外周血以及组织单细胞检测T、B、NK细胞均显著减少;4.Fah背景小鼠以及转基因FNSG小鼠在断药后于野生型小鼠相比,体重逐渐减轻;其肝脏组织的病理切片显示与正常小鼠相比,Fah背景小鼠肝组织损伤,肝小叶变形,肝细胞索紊乱并有大量炎性细胞浸润;Fah背景小鼠具有且单基因免疫缺陷时,肝脏损伤更为严重,肝小叶消失,肝细胞索严重紊乱;FNSG小鼠,切片已完全失去正常结构,损伤坏死严重。结论免疫缺陷肝损伤小鼠模型是非常有实用价值的模式动物,可以通过移植人类免疫细胞和肝脏细胞实现人类免疫系统以及肝脏系统的双重建,对免疫学、再生医学、肿瘤学研究具有重要指导意义。