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第一部分 采用RT-qPCR方法检测六种PDGF家族及其受体基因在急性白血病中的mRNA表达及其临床意义[目的]通过RT-qPCR方法检测PDGF家族及受体基因PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D及其受体PDGFR-A、PDGFR-B在急性白血病患者骨髓单个核细胞(Bone Marrow mononuclear cells,BMMCs)中的mRNA水平表达及其临床意义。[方法]收集2018年03月至2019年03月就诊于苏州大学附属第一医院的91例初诊急性白血病患者及19例的正常供体的骨髓样本,采用Ficoll梯度离心方法提取骨髓单个核细胞中的总RNA,并行逆转录,实时荧光定量PCR方法检测急性白血病患者骨髓单个核细胞中PDGF家族及受体基因PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D及其受体PDGFR-A、PDGFR-B的mRNA表达水平的差异。结合患者性别、年龄,初诊时血常规、骨髓FAB分型、染色体核型、融合基因、基因突变结果,以及WT1、EVI1定量水平,分析6种PDGF相关基因的表达水平与上述临床特征的相关性。[结果]1、91例初治急性白血病包括急性髓系白血病(AML)63例,急性淋巴细胞白血病(ALL)24例,急性混合细胞白血病(HAL)4例。AML组中M0 1例、M1 6例、M2 34 例、M3 7 例、M4 14 例、M5 1 例;ALL 组中 B-ALL 20 例(Ph+B-ALL 8 例,Ph-B-ALL 10例,Ph-like B-ALL2例),T淋系ALL4例。56例AML患者染色体核型检测结果示(不包括M3):单体核型1例,11q23 1例,正常核型33例,del(9)2例,+83例,+21 3例,t(8;21)5例,inv16 1例,其他异常7例。基因突变检测结果示:CEBPα双突变22例,突变率 39.39%;FLT3-ITD+14例,突变率 25.00%;FLT3-TKD+5例,突变率 8.93%;NRAS+11 例,突变率 19.64%;NPM1+10 例,突变率 17.86%;WT1+10 例,突变率 17.86%;DNMT3A+9 例,突变率 16.07%;TET2+6 例,突变率10.71%;其中同时合并NPM1+FLT3-ITD+7例;多重PCR检测结果:AML1-ETO融合基因阳性6例,CBF β-MYH11融合基因阳性4例,MLL相关融合基因阳性5例,其他融合基因阳性2例,融合基因阴性39例,其中WT1融合基因大于150copies 50例,EVI1融合基因大于150copies 6例。按照2017年NCCN急性髓系白血病治疗指南将AML(未纳入M3)分为预后不良组20例,预后中等组19例,预后良好组17例。20例B-ALL患者染色体核型检测结果示:t(9;22)8例,正常核型7例,11q23 2例,del(9)1例,其他异常核型2例;基因突变结果:TP53+3例,ETV6+3例,FLT3-ITD+2 例,FLT3-TKD+1 例,PTPN+2 例,CSMD1+2 例;多重 PCR检测结果:BCR-ABL融合基因阳性8例,E2A-PBX融合基因阳性3例,MLL相关融合基因阳性2例,其中WT1融合基因大于150copies 13例,EVI1融合基因大于150copies 3例。根据2016版中国成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南将20例B-ALL患者均列为高危组。2、与健康对照组相比,PDGF-A基因mRNA的表达量在急性白血病组升高(P<0.05),同时ALL组较AML组表达显著增高(P<0.05);PDGF-B基因的表达水平在患病组与健康组之间无明显差异(P>0.05);PDGF-C基因mRNA在ALL组表达明显降低(P<0.001);PDGF-D基因在AML组表达明显增高(P<0.05);受体PDGFR-A基因mRNA的表达量在急性白血病组升高(P<0.05),ALL组与AML组之间表达无差异(P>0.05);PDGFR-B基因mRNA在ALL组表达升高(P<0.05)。在AML组中,PDGF-A、PDGF-D 和 PDGFR-A 高表达于非 M3 的 AML(P<0.05)。在 ALL 组中,PDGF-A、PDGF-C、受体 PDGFR-A、PDGFR-B等4种基因 mRNA 在 B-ALL 组和 T-ALL组表达无明显差异(P>0.05)。非M3的AML患者中,PDGF-A基因表达水平与PDGFR-A表达水平呈正相关(r=0.707,P<0.0001);在B-ALL中PDGF-A和PDGF-C基因的表达与受体PDGFR-A和PDGFR-B基因表达没有明显相关性(P>0.05)。3、分析了 56例非M3型AML患者PDGF-A、PDGF-D和PDGFR-A基因表达水平与临床特征的相关性,我们发现PDGF-D基因mRNA高表达于染色体核型正常的AML患者中;而33例染色体核型正常的AML患者中,PDGF-D基因mRNA高表达于NPM1+组(P=0.008),低表达于 CEBPα+组(P=0.003)。PDGF-A、PDGF-D 和 PDGFR-A 基因的mRNA表达水平与患者不同性别、年龄、FAB分型、低中高危险分层、初诊时血细胞计数水平、骨髓原始细胞计数水平、融合基因类型、WT1定量、EVI1定量水平及其他基因突变类型等临床因素无明显相关(P>0.05)。分析免疫分型表达与PDGFA、PDGF-D和PDGFR-A基因mRNA表达的相关性,在14例M4患者中,CD34阳性组的PDGFR-A基因mRNA表达水平较阴性组明显升高(P=0.009),PDGF-A、PDGF-D基因mRNA表达情况与免疫表型无明显相关(P>0.05)。4、我们分析了 20 例 B-ALL 患者的 PDGF-A、PDGF-C、PDGFR-A 和 PDGFR-B基因mRNA水平表达与临床特征的相关性,发现PDGFR-B基因mRNA表达量与初诊时外周血白细胞计数呈正相关(r=0.668,P=0.001);Ph染色体阳性B-ALL患者的PDGF-A和PDGFR-A基因的mRNA表达水平明显高于Ph染色体阴性的B-ALL患者。PDGF-A、PDGF-C、PDGFR-A和PDGFR-B基因的mRNA表达水平与性别、年龄、初诊时外周血红蛋白计数水平,血小板计数水平、骨髓原始细胞计数水平,融合基因类型、WT1定量和EVI1定量水平及基因突变类型等临床因素无明显相关(P>0.05)。在12例Ph染色体阴性B-ALL患者中,PDGF-C低表达于CD7阳性组(P=0.0201)。[结论]:1.急性白血病 BMMCs 中 PDGF-A,PDGF-D 和 PDGFR-A 基因 mRNA 在 AML患者中高表达,而PDGF-A,PDGFR-A和PDGFR-B基因mRNA在B-ALL中高表达,PDGF-C在B-ALL呈现低水平表达。2.在AML中PDGF-D基因mRNA高表达于正常染色体患者,并与NPM1和CEBPα基因突变存在一定的相关性,而在B-ALL中,PDGF-A和PDGFR-A基因的mRNA表达可能与Ph染色体存在一定相关性。第二部分 PDGF家族及其受体基因表达对急性白血病患者预后的影响[目的]分析急性白血病患者BMMCs中PDGF家族及其受体基因mRNA表达对预后的影响。[方法]对76例急性白血病患者进行随访,所有患者均接受1-2疗程诱导化疗和2-4疗程的巩固化疗。结合患者临床基本特征及骨髓形态、免疫分型、染色体核型、融合基因结果、基因突变等临床资料,采用卡方检验(Chi-sqaure test)和曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)等统计方法分析相关基因的mRNA表达差异和临床因素对患者化疗敏感率的影响,并用Logistics多因素回归找出影响疗效的独立因素。采用Kaplan-Meier分析影响患者总体生存率(OS),无病进展生存率(PFS),累积复发率(CRR)的因素,采用对数秩检验(Log-rank test)比较差异的显著性。采用Cox回归多因素分析找出影响预后的独立危险因素。[结果]1、76例患者随访终点为2019年12月9日,中位随访时间14(1～17)月,持续缓解49例,复发22例,死亡18例(包括复发后死亡13例),总体生存率(OS)为72.20%,无病进展生存率(PFS)为60.96%,累积复发率(CRR)为39.04%。56例AML患者均接受了 1-2疗程的诱导化疗方案,1疗程诱导化疗后达CR41例,PR10例,NR 5例,接受2疗程诱导化疗获得CR 13例;至随访终点,持续缓解30例,复发15例,死亡13例(包括复发后死亡10例),中位生存时间14个月,1年OS率为80.34%,1年PFS率为63.46%,1年累积复发率为29.3%。B-ALL组1疗程诱导化疗达CR 15例,NR3例,PR2例,5例NR/PR患者经2疗程诱导化疗达CR4例,PR1例。至随访终点时,持续缓解13例,复发7例,死亡5例(均为复发后死亡)。中位生存时间12个月,1年OS率为75%,1年PFS率为65%,1年累积复发率为35%。2、在AML患者(不包括M3)中,我们分析了 PDGF-A、PDGF-D、PDGFR-A基因表达水平和患者临床特征对化疗敏感率的影响,发现PDGF-A、PDGF-D、PDGFR-A的基因表达量在完全缓解组(CR)与非完全缓解组(PR+NR)组之间无明显差异(P>0.05),同时临床因素对患者疗效无明显影响(P>0.05)。采用Kaplan-Meier行单因素生存分析,PDGF-A、PDGF-D、PDGFR-A基因mRNA表达水平对患者OS、PFS、CRR无明显影响(P>0.05),将单因素分析中可能影响患者OS、PFS和CRR的临床因素纳入Cox多因素回归发现免疫表型CD11b+、融合基因WT1阳性可能是影响AML患者OS的独立危险因素(P<0.05);融合基因WT1阳性可能是影响AML患者PFS独立危险因素(P=0.029)。结合第一部分相关临床因素进行生存分析,PDGF-D基因表达水平对染色体核型正常患者的OS、PFS、CRR无影响(P>0.05)。33例染色体核型正常的患者中,NPM1+AML患者的OS在PDGF-D基因mRNA高表达组显著高于低表达组(P=0.0047)、而PFS和CRR无明显差异(P>0.05),NPM1-AML患者中PDGF-D基因水平对其OS、PFS、CRR无明显影响(P>0.05)。在CEBPα-AML中,患者OS在PDGF-D基因高表达组显著高于低表达组(P=0.003)、而PFS、CRR无明显差异(P>0.05),CEBPα+组PDGF-D基因高表达组与低表达组患者的OS、PFS、CRR无明显差异(P>0.05)。3、我们发现 B-ALL 患者的 PDGF-A、PDGF-C、PDGFR-A、PDGFR-B 等基因mRNA表达水平和各临床因素对其首次诱导化疗敏感率无明显影响(P>0.05)。Kaplan-Meier 进行生存分析发现 PDGF-A、PDGF-C、PDGFR-A、PDGFR-B 基因表达水平对患者的OS、PFS、CRR无明显影响(P>0.05),同时Cox多因素分析发现临床因素对患者总生存、无病进展生存以及复发无明显影响(P>0.05)。结合第一部分的临床因素进行生存分析,PDGF-A、PDGFR-A基因表达水平对Ph+B-ALL患者的OS、PFS、CRR的影响无明显差异(P>0.05)。PDGFR-B基因表达对高白细胞患者的 OS、PFS、CRR 无明显影响(P>0.05)。[结论]染色体核型正常的AML患者的PDGF-D基因表达可能进一步影响NPM1+AML和CEBPα-AML患者的总生存。