论文部分内容阅读
胆管癌是指发生在肝外胆管的肿瘤,恶性程度高,早期诊断和治疗都比较困难。其危险因素包括先天性胆管囊肿,胆石症和原发性硬化性胆管炎等等。胆管癌的发病率在全球范围内有逐渐上升趋势。最近,越来越多的学者都在研究microRNA与肿瘤的关系。microRNA是一类内源性的非编码RNA,由19-25个左右核苷酸组成,通过与靶mRNA的3’-UTR碱基互补配对,抑制nRNA翻译或直接使其降解,使靶基因的表达在转录后水平受到抑制,从而调控基因表达。尽管目前对microRNA生物学功能的了解仍然十分有限,但是可以肯定的是,microRNA在生物体的发育、生长、分化、凋亡及肿瘤形成等众多方面具有非常重要的调节作用,特别是在一些恶性肿瘤中,microRNA通过调控不同的靶基因而起到类似于原癌基因或抑癌基因的作用。许多研究表明,miR-138与多种肿瘤有关,如舌癌、肝癌、鼻咽癌等。然而,miR-138在胆管癌中的表达模式迄今未见报道。本文拟对miR-138在胆管癌中的表达及相关功能进行实验研究。由此,我们设计如下实验：1.研究miR-138在人胆管癌细胞系及正常胆管上皮细胞中的表达特点,探讨其表达水平与肿瘤细胞的关系；转染miR-138成熟体(mimics)和miR-138抑制剂(inhibitor),观察其对胆管癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的影响。2.在生物信息学靶基因预测的基础上,发现MiR-138的可能靶基因RhoC。构建携带RhoC3’-UTR序列的psiCHECK2报告基因载体,利用荧光素酶报告基因技术,验证miR-138与RhoC基因的靶向关系；同时转染,miR-138mimics和miR-138inhibitor,检测胆管癌细胞中RhoC基因的变化情况。3.研究miR-138及其靶基因RhoC在胆管癌组织中的表达,探讨两者与胆管癌临床特征及病理的关系。第一章MiR-138表达与胆管癌细胞系生物学行为的实验研究目的：1.研究miR-138在人胆管癌细胞系及正常胆管上皮细胞中的表达特点,探讨其表达水平与肿瘤细胞的关系。2.探讨miR-138对胆管癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的影响。方法：1.采用实时定量PCR (Real-Time PCR)检测胆管癌细胞系(HCCC-9810,RBE,QBC939)及正常胆管上皮细胞(HIBEC)中miR-138的表达；2.细胞实验,将实验分成四组：1)miR-138组：瞬时转染miR-138mimic的胆管癌细胞；2) miR-138inhibitor(抑制)组：在miR-138组的基础上转染miR-138inhibitor的胆管癌细胞；3)阴性对照组(NC)：转染空质粒的胆管癌细胞；4)空白对照组(Con)：未转染的胆管癌细胞。以Real-Time PCR检测转染效果。运用MTT、流式细胞学、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验分别检测各组胆管癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的变化。结果：1.miR-138在胆管癌细胞系中表达降低,明显低于正常胆管上皮细胞(P<0.05),说明miR-138在胆管癌细胞中可能起抑制作用；其中在QBC939细胞表达最低,选取其作为后续实验的研究对象。2.miR-138组中的miR-138表达明显高于对照组和抑制组；而抑制组中miR-138的表达明显低于对照组(P<0.05),说明转染成功。3.QBC939细胞实验结果：1)MTT法绘制生长曲线结果显示,miR-138组细胞的增殖低于对照组；miR-138inhibitor组细胞增殖高于对照组,结果有显著差异(P<0.05)。2)流式细胞结果,各组凋亡率分别为：Con4.22±0.65%, NC4.91±0.71%, miR-138组18.42±2.37%, miR-138inhibitor组2.98+0.43%。miR-138组的凋亡率明显高于对照组及抑制组(P<0.05)；3)Transwell侵袭实验结果,miR-138组的侵袭能力明显受到抑制,而miR-138抑制组的侵袭能力明显加强,两组与Con和NC组对比有显著性差异(P<0.05),4)细胞划痕实验：培养24h后,inhibitor组细胞间平均距离为2.79+0.05mm,较Con组3.85+0.03mm和NC组3.83+0.03mm组有明显差异(P<0.05),而此时miR-138组4.45+0.04mm与Con和NC组间差异不明显；当培养48h后,miR-138组与Con和NC组间出现明显差异(P<0.05),此时inhibitor组与对照组间呈显著性差异(P<0.01)。以上实验Con和NC组均无显著性差异。结论：1.miR-138在胆管癌细胞系HCCC-9810、RBE、QBC939中的表达明显低于正常肝内胆管上皮细胞。2.miR-138可抑制胆管癌细胞QBC939的增殖、侵袭及迁移能力,促进细胞凋亡。第二章miR-138与RhoC靶基因关系的鉴定目的：1.通过生物信息学找出miR-138的可能靶基因,并对其靶向关系加以验证。2.检测靶基因在胆管癌细胞系中的表达。方法：1.运用]miRNA特异性靶点预测平台：PicTar, miRanda和RargetScan预测miR-138的靶基因。2.靶基因的鉴定：1)采用荧光素酶报告基因技术,检测miR-138与其靶基因结合后荧光素变化。3.运用Real-Time PCR和Western Blot检测miR-138与其靶基因结合后靶基因mRNA和蛋白的变化情况。结果：1.找到miR-138的可能靶基因RhoC;2.荧光素酶活性检测结果：各组的Luciferase值分别为：Con组=2.236±0.008, miR-138组=1.328±0.011、inhibitor组=2.235±0.008、NC组=2.227±0.005、NC inhibitor组=2.232±0.001。其中miR-138组较Con组和NC组比较,具有显著性差异(P<0.05)3. Real-Time PCR结果,miR-138inhibitor组中的RhoC mRNA表达水平明显高于Con组和NC组(P<0.05)；而转染miR-138mimics组中RhoC mRNA表达水平明显低于Con组和NC组,结果有显著性差异(P<0.05)4.miR-138组的RhoC蛋白表达水平明显受到抑制,而miR-138inhibitor组的细胞中RhoC蛋白表达水平显著上升,与Con和NC组对比有统计学差异(P<0.05)结论：1.RhoC基因是miR-138的靶基因之一,其3’-UTR序列中存在miR-138的作用靶点。2.QBC939细胞中miR-138与RhoC mRNA和蛋白表达水平呈显著负相关。第三章MiR-138和RhoC在胆管癌中的表达及临床意义目的：检测胆管癌组织和正常胆管组织中miR-138和RhoC的表达,分析其与临床病理特征的关系。方法：RNA原位杂交法检测76例胆管癌和10例正常胆管石蜡切片标本中miR-138的表达；免疫组化SP检测标本中RhoC的表达结果：1.MiR-138在76例胆管癌中有42.1%(32/76)阳性表达,而10例正常胆管组织中有90.0%(9/10)阳性表达,两者间有明显差异(P<0.05)。2.RhoC在76胆管癌组中有73.7%(56/76)阳性表达,而正常胆管组织中只有20.0%(2/10)阳性表达,两者间有显著差异(P<0.05)。3.miR-138在高中-分化组、无淋巴结转移组和无远处转移组的阳性表达率为52.3%、55.3%和51.6%,明显高于低分化组、有淋巴结转移组和有远处转移组的28.1%、24.1%和16.7%(P<0.05)。RhoC在高中-分化组、无淋巴结转移组和无远处转移组的阳性表达率为63.6%%、59.6%和68.8%,而在低分化组、有淋巴结转移组和有远处转移组分别为87.5%、96.6%、100%,两者比较差异显著(P<0.05)。结论：1.miR-138在胆管癌中低表达；RhoC在胆管癌中高表达。2. miR-138、RhoC与胆管癌组织学分化程度、淋巴结转移和远处转移有关。3.miR-138和RhoC在胆管癌组织中的表达呈负相关性。