随着人们生活水平的日益提高,饮食结构的逐渐改变,心血管疾病的发病率呈逐年攀升的趋势,尤其是心肌梗死近期及远期并发症不但威胁人类生命,而且严重影响人们的生活质量。尽管人体的心肌细胞存在分裂增殖的现象已见诸报端,但是每年仅1%的更新比率较难弥补心肌梗死后受损的心肌细胞数量,因此在改善心功能方面成效甚微。目前临床上治疗心肌梗死旨在挽救非梗死区心肌细胞,改善心功能;然而无论是药物治疗或者介入治疗,抑或外科手术都不能使梗死区的心脏功能得以恢复,瘢痕组织取代受损的心肌细胞,导致心脏收缩功能下降,疾病的最终转归结局为心力衰竭(heart failure,HF)。针对心肌梗死最为完善的治疗措施应当保证心脏在形态学及功能上得以修复。心脏移植不失为一种行之有效的现代治疗手段,然而因为供体来源不足、免疫排斥反应无法规避及手术费用高昂等缘故,难以在临床广泛推广。近年来,多位学者研究指出:将心肌样细胞移植至心梗后的心脏后,梗死区心肌细胞得以修复,心脏功能随之而改善。这无疑为缺血性心脏病的治疗迎来新的曙光。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)是一种多能干细胞,因具有取材简便、易于体外分离培养与扩增、多向分化潜能以及自体移植无免疫排斥等优点而成为集中研究的对象;目前已成为组织工程领域理想的种子细胞。毫无疑问,移植治疗成功的关键在于供体细胞状态良好,选用适宜的诱导剂因而显得至关重要。当前已有较多研究涉及药物诱导、物理及生物因素干预等诱导方式。其中诱导药物包含化学药品、多种细胞因子及中药有效单体,物理干预包括仿生电刺激、外加磁场与流体切应力作用,生物因素干预包含体外模拟心肌微环境、细胞裂解液共培养和相关的基因转染。已有研究之中存在着联合两种诱导方式作用于bmmscs培养过程的实例。碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bfgf,fgf-2)属于成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,fgf)家族,广泛地分布于体内几乎所有的器官与组织,其中多数存在于下丘脑与垂体中。fgf-2是一种强效的促细胞分裂剂,可以刺激各类干细胞的迁移、增殖和分化。研究指出经fgf-2转染的mscs在低氧条件下生存能力与抗细胞凋亡特性均增强。wnt-11属于wnt蛋白家族,在胚胎心室和心房中表达。wnt-11控制早期心肌发育并且对心脏功能的正常发育至关重要。已有研究指出wnt-11在心脏发育期间控制心肌细胞的空间组织,有学者认为,在细胞培养模型中,wnt-11信号转导决定心肌细胞的命运并促进心肌细胞的定向分化。基于上述研究,本课题将fgf-2与wnt-11作为诱导剂,诱导bmmscs向心肌样细胞分化;探究它们在bmmscs向心肌样细胞分化过程中的作用,在这一阶段观察细胞形态的改变,分析相关特异性基因的表达;并且就细胞的分化而言探索两者联合运用是否优于各自单独诱导。期待借此提升细胞的分化效率,为bmmscs诱导分化成心肌样细胞通过细胞移植临床治疗心肌梗死提供理论依据。本研究所需的bmmscs均取自3周龄清洁级sd大鼠的长骨骨髓,运用全骨髓贴壁法进行培养。倒置相差显微镜下可见:原代bmmscs体积及胞核较小,部分细胞培养约12h后贴壁生长;24h后细胞形态初步发生改变,已有部分胞体向外舒展,附着在培养瓶的生长面;约72h后大小及长短不一的突起自部分胞体朝外周伸出,细胞主要为短梭形,椭圆形与不规则形也可见,外形上与成纤维细胞大致相像。培养过程中呈悬浮生长的造血干细胞经多次换液及传代后被弃除,细胞形态及排列随时间延续逐步趋向一致。既有研究表明:bmmscs可表达cd29、cd50、cd90等间充质细胞系及内皮细胞系的表面抗原,而不表达cd14、cd45等造血细胞系表面抗原。本研究运用流式细胞仪对bmmscs联合表面抗原进行鉴定,结果显示经全骨髓贴壁法分离培养的bmmscs表面抗原cd29、cd90的阳性表达率分别为97.9%,99.5%。cd45的阳性表达率为0.4%。表明体外培养的bmmscs符合间充质干细胞的特点。取长势良好的第2代bmmscs,培养48h后分为4组,a、b、c组分别加入含fgf-2、wnt-11、fgf-2+wnt-11的诱导培养基,d组为空白对照组。诱导72h后更换为完全培养基,在此期间空白对照组仅使用完全培养基,此后继续常规培养4w。检测各组bmmscs在形态学与分子水平发生的变化。在倒置相差显微镜下观察得见:经诱导培养约48h后,圆钝而平滑的突起由胞体向外周伸出,细胞主要为梭形,椭圆形及不规则形也可见;1w时细胞形态及排列逐渐变为均一、规则的长梭形;4w时相邻细胞间联系紧密,排列规则,生长方向趋于一致,部分细胞形成漩涡样结构。常规培养至第4w时,运用免疫细胞化学技术检测各组细胞中结蛋白(desmin)、间隙连接蛋白43(connexin43)、心肌肌钙蛋白i(cardiactroponini,ctni)的表达情况。结果表明:各诱导组bmmscs胞质中desmin、connexin43及ctni均呈阳性表达,上述三者于空白对照组bmmscs胞质中均呈弱阳性或阴性表达。运用透射电镜(transmissionelectronmicroscopy,tem)对各诱导组bmmscs进行观察,结果表明诱导后的bmmscs胞质内可见较多的粗面内质网与线粒体、糖原及核糖体等细胞器,还有平行排列的肌丝;胞核为卵圆形,居中。与心肌细胞的超微结构类似。实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-timequantitativepolymerasechainreaction,rt-qpcr)检测各组bmmscs在常规培养第1、2、4w时心肌早期转录因子gata-4、nkx2.5及α-mhc的表达,结果表明:各组细胞均不表达α-mhc,fgf-2及wnt-11诱导组在第1w时表达gata-4、nkx2.5,在第2w时表达减弱,在第4w时表达增强,fgf-2联合wnt-11诱导组在第1w时呈弱表达,在第2w及第4w时表达逐渐增强,第4w时联合诱导组基因表达均显著高于各单独诱导组基因表达(p<0.05)。经由本实验,能够说明:1.BMMSCs在体外培养过程中可经FGF-2与Wnt-11各自单独诱导及两者联合诱导方式定向分化为心肌样细胞。2.与FGF-2、Wnt-11单独诱导BMMSCs向心肌样细胞分化的作用效果相比,两者联合的诱导效果更佳。