近几年,本研究室在田间调查中发现,猕猴桃病毒病在我国保存的猕猴桃种质资源及栽培猕猴桃植株上发生较普遍。为明确侵染我国猕猴桃的病毒种类、危害特点及其分子特性,本研究根据已报道的猕猴桃病毒序列合成或设计引物,采用RT-PCR技术首次在从我国种植猕猴桃上检测到猕猴桃病毒A(Actinidia virus A,Ac VA)和猕猴桃病毒B(Actinidia virus B,Ac VB),并通过对扩增产物的序列分析,明确对其分子特性和变异特点。此外,采用小RNA(s RNA)深度测序技术从猕猴桃上鉴定出一种新的Emaravirus属病毒,并对其基因组结构进行分析。取得的研究结果如下:1.2013-2014年,从湖北、安徽、陕西、浙江、江西和云南6省共采集6个种(或亚种)及其它未知种猕猴桃叶片样品151份,多数采样植株的叶片表现褪绿斑驳、褪绿环纹、脉黄和花叶等症状。采用RT-PCR技术对这些猕猴桃样品的Ac VA和Ac VB进行检测,在所收集的中华猕猴桃、美味猕猴桃、软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃、葛枣猕猴桃和毛花猕猴桃样品中,均检测到Ac VA或Ac VB,检出率分别为15.2%和17.9%。2.采用3对引物分别扩增Ac VA的ORF1、ORF4和ORF5部分片段,扩增产物序列分析结果显示,Ac VA的ORF1、ORF4和ORF5扩增片段序列存在较大分子变异,不同分离物的269bp片段(ORF1)核苷酸序列相似性为77.3-99.3%。ORF4扩增片段大小为597bp,分离物间的核苷酸序列相似性为88.1-99.8%。所测定分离物与新西兰分离物TP7-93A相应片段的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为88.4-90.6%和94.2-100%。ORF5扩增产物为283bp,各分离物间扩增片段的核苷酸序列相似性为89.0-100%,与新西兰报道的Ac VA分离物TP7-93A的相应片段的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为90.1-94%和94.6-96.8%。在基于各扩增片段核苷酸序列的系统进化树中,Ac VA分离物聚为2-3组。3.采用两对引物Ac VB5F/Viti3’R和Ac VB5F/Ac VB5R分别获得3个和20个Ac VB分离物的ORF5片段序列。引物Ac VB5F/Ac VB5R扩增产物大小为342bp或338bp。序列分析结果显示,各分离物的ORF5扩增片段之间的核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为81-100%和75.5-100%。所测定分离物与新西兰报道的Ac VB分离物TP7-93B相应片段的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为83.9-99.7%和79.8-100%。这些分离物在系统进化树中聚为3组。4.采用s RNA深度测序方法,从猕猴桃样品Ac HN-6鉴定出一种新病毒,命名为猕猴桃褪绿环斑伴随相关病毒(Actinidia chlorisis ringspot-associated virus,ACRa V)。测定了该病毒基因组序列。ACRa V为负单链RNA病毒,基因组由5条RNA链组成,RNA1-RNA5大小分别为7061nt、2267nt、1678nt、1664nt和1476nt,每条RNA链包含一个开放阅读框(ORF),ORF1,ORF2和ORF3分别编码依赖RNA的RNA聚合酶(Rd Rp)、糖蛋白(GP)和外壳蛋白(CP),推测ORF4编码运动相关蛋白,ORF5编码蛋白的功能未知。ACRa V基因组结构与欧洲山梣环斑病毒属(Emaravirus)病毒相似,ORF1-4编码的蛋白(P1-P4)与紫荆黄色环斑病毒(Redbud yellow ringspot virus,RYRV)的相应蛋白氨基酸序列相似性最高,分别为64.6%,48.3%,55.6%和51.9%;P5与该属其它病毒相应蛋白氨基酸序列相似性低于23%。在基于该病毒的P1-P3的氨基酸序列及布尼亚病毒科(Bunyaviridae)不同属的代表种相应蛋白序列的进化树中,ACRa V与Emaravirus属病毒聚在同一分支。这些结果表明,ACRa V为Emaravirus属的一个新种。5.在ACRa V的ORF1和ORF3区域设计了两对特异性引物,采用RT-PCR技术,对从7个省收集的146份猕猴桃样品进行了ACRa V检测,其中36份样品的ACRa V检测结果为阳性,检出率为24.6%。