论文部分内容阅读
目的:1.本研究拟探索miR-29b/c在急性髓细胞白血病(AML)中表达状况及临床意义;2.探讨miR-29b/c在DNMT抑制剂地西他滨(DAC)耐药中的作用。方法:1.收集102例AML患者和25例健康对照的骨髓标本,提取骨髓单个核细胞;提取骨髓单个核细胞进行RNA和DNA提取,并将RNA逆转录为cDNA;DNA进行亚硫酸盐修饰。2.应用实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)检测102例AML患者和25例健康对照的骨髓单个核细胞中miR-29b/c的表达水平,并使用SPSS20.0软件对临床数据进行统计分析。3.应用亚硫酸氢盐测序PCR方法(BSP)检测K562细胞株、K562加药株和K562耐药株(K562/DAC)和中miR-29b/c的甲基化水平。采用RT-PCR检测K562加药株、K562耐药株(K562/DAC)和K562细胞株中miR-29b/c的表达情况,分析甲基化和表达的相关性。4.构建miR-29b和miR-29c过表达质粒并通过HiperFect转染miR-29b/c低表达细胞株(K562)和DAC耐药细胞株(K562/DAC),通过流式细胞仪和抗生素筛选获得稳定过表达miR-29b和miR-29c的K562细胞株(K562-miR-29b和K562-miR-29c)和DAC耐药细胞(K562/DAC-miR-29b和K562/DAC-miR-29c);采用RT-PCR鉴定转染细胞株中miR-29b/c表达。5.构建miR-29b/c反义抑制质粒(inhibitor)并转染高表达miR-29b/c的白血病细胞(HEL),得到低表达miR-29b/c细胞(HEL-miR-29b-inhibitor和HEL-miR-29c-inhibitor),进一步验证miR-29b/c在DAC耐药中作用。6.采用CCK-8法检测miR-29b/c对白血病细胞株和耐药细胞株对DAC敏感性影响并计算IC50;检测miR-29b/c表达改变对细胞生长的影响;采用Annexin V PE/7-AAD法分析miR-29b/c对细胞凋亡的影响。结果:1.在aml中,mir-29b/c表达水平较健康对照相比明显降低(p均小于0.001)。roc曲线显示mir-29b和mir-29c均可在全部核型和正常核型(cn-aml)中区分aml患者和健康对照(p均小于0.001)。对99例具有生存资料的患者进行了生存分析,结果显示在全部核型aml中,mir-29b/c低表达患者较mir-29b/c高表达患者总体生存时间明显缩短(p=0.006和p<0.001);我们在cn-aml中同样发现mir-29b和mir-29c低表达对生存时间具有不良影响(p=0.036和p=0.001)。多因素分析证实在全部aml患者中,mir-29b和mir-29c可能作为影响患者生存的独立预后分子(p=0.042和p=0.033),并且在正常核型中mir-29b和mir-29c亦可能作为影响患者生存的独立预后分子(p=0.037和p=0.020)。2.k562细胞经过dac0μm、0.1μm、1μm、10μm处理后mir-29b和mir-29c的表达呈逐渐递增趋势,mir-29b/c启动子区域甲基化密度依次递减:96.92%、80%、70.77%和49.23%,并且mir-29b/c的表达和其启动子区域的甲基化水平呈负相关关系(p小于0.001)。与k562相比(96.92%),虽然mir-29b/c启动子区域在k562/dac中也发生去甲基现象(72.31%),但是mir-29b和mir-29c在k562/dac细胞中表达水平却下调(分别为p=0.001和p<0.001);提示dac耐药细胞中存在非甲基化依赖性mir-29b/c表达调控异常。3.rt-pcr检测转染mir-29b和mir-29c过表达质粒后k562细胞株和k562/dac细胞株中mir-29b和mir-29c表达情况,结果显示:k562-mir-29b和k562-mir-29c中mir-29b/c表达水平分别上调2.69倍(p=0.001)和3.61倍(p<0.001);k562/dac-mir-29b较k562/dac-nc表达水平上调3.14倍(p<0.001),k562/dac-mir-29c较k562/dac-nc表达水平上调3.37倍(p=0.015)。检测转染mir-29b/c-inhibitor质粒的hel细胞中mir-29b/c表达水平,结果显示:hel-mir-29b-inhibitor的mir-29b表达水平较hel-nc转染株下调2.71倍(p<0.001),hel-mir-29c-inhibitor的mir-29c表达水平较hel-nc下调2.87倍(p<0.001);4.cck8检测mir-29b/c转染后转染株的ic50变化,结果显示:与对照组k562-nc相比,k562-mir-29b(p=0.001)和k562-mir-29c(p<0.001)的ic50显著降低;hel-mir-29b/c-inhibitor的ic50较hel-nc显著增高(p均小于0.001);k562/dac-mir-29b和k562/dac-mir-29c的ic50值显著低于对照组K562/DAC-NC(P值分别为P=0.004和0.001);以上结果提示细胞抑制率与DAC浓度成计量依赖关系。5.MiR-29b/c转染株培养0h、24h、48h、72h后,K562-miR-29b和K562-miR-29c的生长速度明显慢于对照组(P均小于0.001);HEL-miR-29b/c-inhibitor的生长速度较对照相比,明显升高(P均小于0.001);K562/DAC-miR-29b/c的细胞生长速度显著低于空白对照(P均小于0.001),提示miR-29b/c可能抑制白血病细胞和耐药细胞生长。6.MiR-29b/c转染株培养48h后,流式细胞仪检测细胞凋亡,结果显示与K562-NC比较,K562/DAC-miR-29b/c的细胞凋亡率显著上升(P=0.006和P=0.001);与转染HEL-NC比较,HEL-miR-29b/c-inhibitor细胞的凋亡率显著下降(P=0.001和P<0.001),提示miR-29b/c可能有促进白血病细胞和耐药细胞凋亡的作用。结论:1.我们发现miR-29b/c在初发AML患者中存在异常低表达,并且miR-29b/c低表达可能预示全部核型AML患者和CN-AML患者的不良预后。2.去甲基化药物DAC能够通过使miR-29b和miR-29c启动子发生去甲基化改变而上调其表达;但在DAC耐药的K562细胞(K562/DAC)中却发现miR-29b和miR-29c启动子区发生去甲基化改变,而其表达水平并未上调;提示DAC耐药过程中可能存在着miR-29b/c非甲基化依赖性的表达下调3.MiR-29b/c过表达能够增加白血病细胞对DAC的敏感性、逆转DAC耐药株对DAC的耐药。