目的:以“肠道菌群—黏膜屏障”为着眼点,对中医经典药对“黄芩—黄连”治疗2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）的相关问题进行研究。拟在进一步明确芩-连通过抑制脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）介导的代谢性炎症而发挥T2DM治疗效用的基础上,探索芩-连修复T2DM肠黏膜损伤的分子机制;应用16Sr RNA高通量测序及SD大鼠、ICR小鼠两种动物模型,探索芩-连的药理作用是否是通过靶向某种肠菌而实现的;另外,亦从“肠菌—黏膜”视角探究芩-连配伍（相须为用）、量效（重剂起沉疴）以及副作用（戕伐脾土）的相关证据,为芩-连在临床的合理运用提供参考。方法:本研究以高脂饮食+链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导的T2DM大鼠及小鼠为实验对象。其中大鼠实验分为空白对照组（NC组）,T2DM模型组（DC组）,T2DM+芩-连高、中、低剂量组(8.4,4.2和2.1g·kg^-1·day^-1,DHSC,DMSC和DLSC组),正常大鼠+芩连中剂量组(4.2g·kg^-1·day^-1,NSC组),二甲双胍组(194.25mg·kg^-1·day^-1,DME组)。通过观察/记录/检测大鼠的一般情况、饮食饮水量、体重、血糖等评估整体状态;通过检测血清胰岛素水平、计算胰岛素抵抗稳态模型（Homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR）指数、葡萄糖耐量实验（Oral glucose tolerance test,OGTT）、胰岛素耐量实验（Insulin tolerance test,IPITT）、血脂及游离脂肪酸（Free fatty acids,FFAs）水平评估大鼠的糖脂代谢情况;应用HE染色+光镜观察胰腺、回肠、结肠组织的病理变化;应用Elisa法检测血清肠黏膜损伤标志物LPS、二胺氧化酶（diamine oxidase,DAO）、D-乳酸（D-lactate,D-LA）以及血清、肠道组织的炎症因子白介素^-1β(Interleukin^-1β,IL^-1β)、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平;应用生化法检测回肠组织超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-PX）、丙二醛（Malonaldehyde,MDA）水平;应用免疫组织化学法检测回肠组织紧密连接蛋白Claudin^-1、ZO^-1、Occludin水平;应用蛋白免疫印迹法检测胰腺组织Toll样受体4（Toll like receptor-4,TLR-4）、核因子-κBp65（Nuclear factor kappa Bp65,NF-κBp65）以及回肠组织TLR-4、TRIF相关接头分子（TRIF-related adaptor molecule,TRAM）、β-干扰素TIR结构域衔接蛋白（β-interferon TIR domain adaptor protein,TRIF）、肿瘤坏死因子受体1(Tumor necrosis factor receptor 1,TNFR^-1)、TNFR相关因子2（TNFR-associated factor 2,TRAF-2）、受体相互作用蛋白激酶1(Receptor-interacting serine/threonine protein kinases,RIPK^-1)、磷酸化的核因子-κB抑制物激酶（Phosphorylated inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,p-IKKβ）以及NF-κBp65蛋白水平;应用16S r RNA扩增子测序检测肠道菌群变化;应用高效液相色谱法检测大鼠粪便乙酸、丙酸、丁酸含量。小鼠实验分为空白对照组（NC组）,T2DM模型组（MC组）,黄芩组(6.7g·kg^-1·day^-1,DS组)、黄连组(6.7g·kg^-1·day^-1,DC组)、芩-连组(13.4g·kg^-1·day^-1,DSC组)及二甲双胍组(308.3mg·kg^-1·day^-1,DME组)。通过观察/记录/检测小鼠的一般情况、饮食饮水量、体重、血糖等评估整体状态;通过检测血清胰岛素水平、计算HOMA-IR指数、OGTT、ITT等评估胰岛素敏感性;应用HE染色+光镜观察回肠、结肠组织的病理变化;应用Elisa法检测血清肠黏膜损伤标志物LPS、DAO、D-LA以及肠道组织的炎症因子IL^-1β、IL-6、IL^-18、TNF-α水平;应用RT-PCR检测回肠组织紧密连接蛋白Claudin^-1、Claudin-2、ZO^-1、Occludin基因表达,运用免疫荧光法检测ZO^-1、Occludin蛋白表达水平;应用16S r RNA扩增子测序检测肠道菌群变化;应用高效液相色谱法检测小鼠粪便乙酸、丙酸、丁酸含量。结果:1.芩-连对T2DM糖脂代谢的影响芩连药对可显著降低T2DM大鼠的血糖及体重、改善血脂（TG、TC、LDL-C、HDL-C）及FFA水平,可促进胰岛素分泌,缓解胰岛素抵抗,且DHSC组效果最佳;芩、连单用及合用均可明显改善T2DM小鼠糖代谢紊乱,且以黄连组及芩-连合用组效果较好。2.芩-连对T2DM代谢性炎症的影响芩连药对可显著降低T2DM大鼠血清LPS及炎症因子IL-6、TNF-α水平（P<0.05,且DHSC组效果最佳）;可明显改善T2DM大鼠胰岛细胞变性坏死及炎细胞浸润;可显著下调T2DM大鼠胰腺组织TLR-4以及NF-κBp65蛋白表达,且DHSC组疗效最佳,呈现出明显的量效差异;相关性分析提示,血清LPS水平与空腹血糖、HOMA-IR、TC、LDL-C、TG、FFA、IL-6、TNF-α存在正相关关系,与体重、胰岛素水平存在负相关关系。3.芩-连对T2DM肠道黏膜屏障的影响3.1.血清标志物DAO、D-LA水平大鼠实验中,相较于NC组,DC组DAO、D-LA水平显著上升（P<0.05）,芩-连干预后,DAO、D-LA水平皆成下降趋势,但仅DHSC组全部数据具有统计学意义（P<0.05）;小鼠实验的结果也呈现出类似的趋势。3.2.肠道组织病理学大鼠、小鼠实验均提示,在高脂饲料+STZ诱导的T2DM动物模型中,回肠和结肠组织呈现出上皮细胞坏死,胞核固缩、碎裂,炎性细胞浸润,肠腺萎缩等病理表现,在芩-连干预组,上述病理改变均有不同程度的缓解。3.3.肠道紧密连接蛋白大鼠免疫组化结果提示:较之NC组,DC组的ZO^-1、Occludin及Claudin^-1蛋白表达量显著降低（P<0.05）,经芩-连干预后,蛋白表达量均呈现出上升趋势（P<0.05）,且中药高剂量的效果更加明显（P<0.001）;小鼠RT-PCR及免疫荧光结果提示MC组ZO^-1、Occludin、Claudin^-1水平明显降低,但Claudin-2水平显著升高,芩连干预后,相应的基因及蛋白表达都有向空白组恢复的趋势。4.芩-连改善T2DM肠黏膜损伤的分子机制4.1.抗炎大鼠实验结果提示:较之NC组,DC组结肠、回肠组织的IL^-1β、IL-6、TNF-α表达显著升高（P<0.05）,经芩-连干预后,炎症因子水平显著下降（其中DHSC组P值均<0.01）;小鼠实验结果提示,较之NC组,MC组回肠组织的IL^-1β、IL-6、TNF-α、IL^-18表达显著升高（P<0.05）,经芩-连干预后,炎症因子水平显著下降（P<0.05）。4.2.抗氧化大鼠实验结果提示:较之NC组,DC组SOD、CAT、GSH-Px水平降低,MDA水平升高（P<0.05）,芩-连干预可明显改善CAT及MDA水平。4.3.TLR-4/TRIF及TNFR^-1/NF-κB信号通路大鼠实验结果提示:较之NC组,DC组TLR-4、TRAM、TRIF、TNFR^-1、TRAF-2、RIPK^-1蛋白表达显著上调（P<0.05）,芩-连干预可显著抑制上述分子表达,且DHSC组效果最佳,呈现出明显的量效差异。5.芩-连对肠道菌群的影响5.1.正常大鼠模型芩-连可降低正常大鼠肠道菌群数量及多样性;门水平上,增加Firmicutes/Bacteroides（F/B）,降低Proteobacteria丰度;科属水平上,增加Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae、Lachnospiraceae NK4A136 group、Prevotellaceae UCG-003丰度,降低Lactobacillaceae、Enterobacteriaceae、Lactobacillus、Escherichia-Shigella丰度;对肠道短链脂肪酸（Short chain fatty acids,SCFAs）的产生有抑制作用。5.2.T2DM大鼠模型芩-连可降低T2DM大鼠肠道菌群数量及多样性;门水平上,可降低Proteobacteria丰度;科水平上,可增加Lachnospiraceae、Prevotellaceae、Erysipelotrichaceae的丰度,且随着中药剂量的提高,芩连促Prevotellaceae增殖的作用逐渐增强,而促Lachnospiraceae增殖的作用逐渐减弱;抑制Enterobacteriaceae,Lactobacillaceae,Bifidobacteriaceae丰度。属水平上,可增加Lachnospiraceae NK4A136group、Prevotella 9、Prevotellaceae UCG-003、Alloprevotella、Prevotellaceae NK3B31 group、Prevotella 1、Coprococcus 2丰度,降低Lactobacillus、Ruminococcaceae UCG-005、Escherichia-Shigella、Ruminococcus 2、Enterobacter、Enterococcus等丰度;可增加肠道SCFAs含量,但差异无统计学意义。5.3.T2DM小鼠模型芩-连可增加T2DM小鼠肠道菌群数量及多样性;门水平上,增加F/B,降低Proteobacteria丰度;科水平上,可显著增加Lachnospiraceae、Rikenellaceae及Ruminococcaceae的丰度,同时降低Enterobacteriaceae的丰度;属水平上,促进Alistipes、Ruminiclostridium 9、Lactobacillus、Lachnospiraceae NK4A136 group增殖,同时下调Escherichia-Shigella、Enterobacter、Desulfovibrio丰度;可增加肠道SCFAs含量,其中丁酸具有统计学意义（P<0.05）。6.芩-连的配伍效应6.1.基于肠黏膜屏障小鼠实验证实,较之单用芩、连,合用能够降低血清LPS、DAO、D-LA水平,改善肠道黏膜损伤,抑制肠道炎症因子IL-6、TNF-α、IL^-1β以及IL^-18表达。6.2.基于肠道菌群小鼠实验证实,较之单用芩-连,合用更能促进Lachnospiraceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、Alistipes、Ruminiclostridium 9、Lactobacillus的增殖以及肠道内丁酸盐的富集;同时,加强对潜在致病菌Proteobacteria、Enterobacteriaceae、Escherichia-Shigella、Enterobacter、Desulfovibrio等的抑制作用;相关性分析提示,上述致病菌与肠道炎症因子水平具有正相关关系。结论:1.肠道菌群紊乱与T2DM“火热浊毒”具有相关性,清热药对“黄芩—黄连”可通过调节肠道菌群,改善黏膜屏障,抑制肠道LPS“渗漏”,纠正T2DM胰腺炎症反应及糖脂代谢紊乱;2.芩-连可通过抑制肠道组织炎症反应及氧化应激修复T2DM肠黏膜损伤,其分子机制涉及对TLR-4/TRIF/NF-κB及和TNFR^-1/NF-κB通路的调控,且高剂量效果最佳。3.芩-连可通过抑制有害菌,增加SCFAs产生菌及抗炎菌来修复肠道黏膜、改善糖脂代谢;较之单用,芩-连配伍可增强上述药理作用,这可能是芩-连“相须为用”的重要原因。4.无论在大鼠还是小鼠模型中,芩-连均可提高Lachnospiraceae和Lachnospiraceae NK4A136 group的丰度,抑制Proteobacteria、Enterobacteriaceae、Escherichia-Shigella以及Enterobacter的增殖,这些肠菌可能为芩-连的“靶向菌群”。5.大鼠实验提示,芩-连“戕伐脾土”机制或与抑制肠道菌群增殖及其多样性、抑制有益菌Bifidobacteriaceae,Lactobacillus的丰度有关,但小鼠实验结果不支持该结论。