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【研究背景】哮喘是一种以慢性气道炎症为特征的变态反应性疾病。近几十年来,支气管哮喘的发病率逐年增加,全球哮喘患者目前已达3亿,严重消耗了大量的医疗卫生资源。哮喘的发病机制主要为自发的对非致病性抗原的过度的免疫反应,表现为以Th2型免疫反应为主的气道炎症,气道高反应性以及气道粘液分泌增加,最终导致气道重塑。哮喘的发病机制与调节性T细胞(Treg)数量减少与功能下降密切相关,研究表明Treg可以通过分泌IL-10,TGF-β等细胞因子或抑制2型固有淋巴细胞(ILC2)等途径抑制哮喘。一些药物可以通过调节Th17/Treg比例抑制哮喘小鼠的过敏性炎症。近些年研究表明肠道菌群紊乱与包括哮喘在内的多种过敏性疾病密切相关。益生菌被定义为在给予适当剂量时对机体产生有益作用的活的微生物。临床和实验室的证据表明益生菌能够调节肠道菌群并调节宿主免疫,促进正常免疫耐受的维持,对过敏性疾病具有一定的治疗作用。然而,益生菌治疗过敏性疾病的有效性及机制尚不明确。本实验在以往的研究基础上,探究6种益生菌的混合制剂对小鼠哮喘的治疗作用及机制。通过卵清蛋白(OVA)建立小鼠的哮喘模型,研究益生菌的混合制剂对小鼠哮喘的影响,并进一步研究益生菌的混合制剂对小鼠Treg,树突状细胞(DC)等免疫细胞的影响。本实验同时研究了益生菌治疗对小鼠肠道菌群的影响。通过上述研究深化对哮喘发病机制的认识以及探究哮喘与肠道菌群的关系,为哮喘的临床诊疗提供新的思路。【研究目的】明确益生菌的混合制剂对小鼠哮喘的治疗作用,探究益生菌的混合制剂治疗小鼠哮喘的作用机制尤其是对小鼠免疫系统的影响。探讨益生菌治疗对小鼠肠道菌群的影响。【研究方法】1)实验选用健康6-8周雄性SPF级小鼠,使用OVA致敏和激发,建立小鼠的哮喘模型;2)使用肺功能仪检测小鼠肺功能;3)收集小鼠的肺泡灌洗液(BALF),进行白细胞计数及分类计数,使用ELISA法检测BALF中IL-4,IL-13,IL-10,IL-17A含量;4)摘取小鼠肺组织进行组织学染色;5)眼球取血收集小鼠血清,检测血清中OVA特异性IgE,IgG1水平;6)流式细胞仪检测小鼠肺引流淋巴结以及肠系膜淋巴结中Treg数量;7)流式细胞仪检测小鼠肠系膜淋巴结CD103~+DC数量;8)体外实验,将肠系膜淋巴结CD103~+DC与na?ve T细胞共培养,检测共培养细胞中Treg数量,ELISA法检测培养上清中IL-4,IL-13水平;9)16srRNA测序检测小鼠肠道菌群。【研究结果】本研究发现模型组小鼠表现为明显的气道高反应性和气道炎症。与空白对照组相比,哮喘小鼠BALF中白细胞数量显著增加,其中主要为嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数量增加;BALF中IL-4、IL-13、IL-17A表达增加,IL-10表达下降;组织学染色显示肺组织炎症细胞浸润明显;血清中OVA特异性抗体表达增加。5×10~7 CFU/ml益生菌治疗后小鼠的气道反应性明显下降;BALF中炎症细胞数量降低;BALF中IL-4、IL-13、IL-17A表达降低,IL-10表达升高;组织学结果显示小鼠肺部炎症明显减轻,血清中OVA特异性抗体表达降低。此外,哮喘小鼠肺引流淋巴结及肠系膜淋巴结中Treg细胞数量相比于对照组明显降低。5×10~7 CFU/ml益生菌治疗明显上调了小鼠肺引流淋巴结及肠系膜淋巴结中Treg细胞数量,并增加了小鼠肠系膜淋巴结中CD103~+DC数量;体外实验发现,5×10~7 CFU/ml益生菌治疗组小鼠相比于模型组,肠系膜淋巴结中CD103~+DC更能够促进初始T淋巴细胞向Treg转化。肠道菌群检测结果表明模型组小鼠肠道菌群多样性降低,菌群构成发生明显改变;益生菌的混合制剂治疗能够调节肠道菌群的多样性,并在门、属等多水平上调节肠道菌群构成。【结论】益生菌的混合制剂治疗能够改善哮喘小鼠的气道高反应性及气道炎症,其中5×10~7 CFU/ml益生菌的混合制剂的治疗效果最佳。我们发现益生菌混合制剂治疗通过上调肠系膜淋巴结中免疫抑制性的CD103~+DC,诱导小鼠肺引流淋巴结及肠系膜淋巴结中Treg细胞生成,对小鼠哮喘具有一定的治疗作用。此外,肠道菌群检测结果发现哮喘小鼠肠道菌群多样性下降且菌群群落构成发生改变,益生菌混合制剂治疗能够增加哮喘小鼠肠道菌群多样性并调节肠道菌群构成,对小鼠肠道稳态的维持具有重要作用。