论文部分内容阅读
胶质瘤（glioma）是一种常见的颅内原发肿瘤,占恶性脑肿瘤的80%,年发病率约为5/100,000,且预后很差。尽管目前诊断和治疗技术都取得了很大的进步,但是胶质瘤患者的生存率仍没有显著提高。近年来,随着肿瘤遗传学和测序技术的飞速发展,在胶质瘤中发现了越来越多的重要遗传学改变,其中异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase,IDH）突变被认为是胶质瘤最重要的遗传学改变。IDH突变广泛存在于胶质瘤中,其中低级别胶质瘤（lower-grade glioma,LGG）和继发性胶质母细胞瘤（secondary glioblastoma）的发生率高达80%以上,但是在原发性胶质母细胞瘤（primary glioblastoma）中发生率仅为5%作用。突变型IDH能够将α-酮戊二酸（α-ketoglutarate,α-KG）转化为D-2-羟戊二酸（D-2-hydroxyglutarate,D-2-HG）,由于D-2-HG和α-KG结构类似,可以竞争性地抑制α-KG依赖的双加氧酶（dioxygenases）,如组蛋白和DNA的去甲基化酶,导致肿瘤表观遗传学等发生改变。微血管增生（microvascular proliferation）是胶质瘤重要特征之一,但是IDH突变胶质瘤的血管结构特点仍不明确。血管周细胞（pericytes）是构成血脑屏障的重要组成部分,对维持血管正常功能极其重要。在胶质瘤中,血管周细胞覆盖的增加往往伴随着较差的预后。作为淋巴管内皮细胞的重要标志,平足蛋白（podoplanin,Pdpn）在淋巴管和血管发育中具有重要的作用。在Pdpn敲除的小鼠中,小鼠表现出自发性出血,血管周细胞减少覆盖并弥散分布在血管周边。我们发现在胶质瘤中,Pdpn在血管周围高表达,并且Pdpn表达水平与胶质瘤级别正相关。然而,Pdpn在胶质瘤血管形成和增殖中的具体作用仍不清楚。本研究利用人胶质瘤组织标本,分析IDH突变对胶质瘤微血管结构、血管周细胞覆盖率以及Pdpn表达的影响。在裸鼠颅内胶质瘤模型中,确定了Pdpn表达与血管周细胞覆盖之间的关系。利用胶质细胞特异性突变型IDH1敲入小鼠,以及表达野生型和突变型IDH1的胶质瘤细胞,探讨野生型和突变型IDH1调节Pdpn表达的分子机制。1)IDH突变胶质瘤中血管周细胞覆盖降低首先,我们利用MRI检测了胶质瘤脑血流量（cerebral blood flow,CBF）,结果发现IDH突变胶质瘤的脑血流量明显低于无IDH突变的胶质瘤。通过免疫组化（immunohistochemistry,IHC）染色发现,IDH突变胶质瘤中CD34阳性微血管密度（microvascular density,MVD）与同类型无IDH突变胶质瘤之间无显著差异,但α-SMA阳性MVD显著低于无IDH突变胶质瘤。进一步IHC染色分析显示,IDH突变胶质瘤微血管NG2和PDGFR-β阳性细胞数量亦显著减少。NG2、PDGFR-β和α-SMA均是微血管周细胞（pericytes）的标志分子,因此提示IDH突变能够减少胶质瘤微血管中周细胞的覆盖,从而影响微血管的结构。2)IDH突变抑制胶质瘤Pdpn表达减少血管周细胞覆盖为了探讨IDH突变胶质瘤微血管结构改变的机制,我们分析了TCGA数据库中胶质瘤mRNA差异,结果发现IDH突变胶质瘤中Pdpn mRNA水平明显减低,而且IHC染色、Western blot和定量PCR（quantitative PCR,qPCR）也提示了相同的结果。此外,IHC染色结果还显示,IDH突变胶质瘤中Pdpn显著降低的同时,微血管NG2、PDGFR-β和α-SMA阳性周细胞覆盖也显著减少,且胶质瘤Pdpn表达水平与α-SMA阳性MVD呈正相关。我们进一步建立了稳定过表达Pdpn的U87和U251胶质瘤细胞,体外研究发现,Pdpn能够促进胶质瘤细胞迁移,但不影响细胞增殖。在体内,通过颅内接种U87细胞建立裸鼠胶质瘤移植模型,我们研究发现,Pdpn过表达促进胶质瘤细胞浸润,增大肿瘤体积,并增加肿瘤中α-SMA和PDGFR-β阳性周细胞的数量。基于以上研究,我们建立了胶质细胞特异性突变型IDH1敲入（IDH1+/LSL-R132Q/LSL-R132Q GFAP-Cre）小鼠,发现新生小鼠脑组织有明显的自发出血,通过HE染色和电镜观察发现,在胶质细胞敲入突变型IDH1能够导致微血管周围间隙增大。免疫荧光提示,Pdpn在血管周围的胶质细胞中表达水平显著较高。脑组织和原代胶质细胞的Western blot和qPCR分析显示,IDH突变能够抑制胶质细胞Pdpn表达,减少α-SMA阳性周细胞覆盖。以上结果表明,IDH突变能够下调胶质瘤中Pdpn表达,抑制胶质瘤血管周细胞的覆盖。3)野生型IDH1促进胶质瘤Pdpn表达正常脑组织内Pdpn的表达水平很低,但无IDH突变胶质瘤中Pdpn表达显著升高。在本研究中,我们意外发现,过表达野生型IDH1（wildtype IDH1,wtIDH1）能够显著增加U87和U251细胞中Pdpn的表达。进一步,我们发现,在无IDH突变的胶质瘤中Pdpn与IDH1 mRNA含量正相关。同时,总IDH1 mRNA含量随着胶质瘤级别升高而升高,且与IDH1是否突变无关。Western blot和IHC染色也显示,IDH1表达水平在胶质母细胞瘤中均显著升高,并与IDH是否突变无关。此外,我们发现IDH1敲除(IDH1LSL/LSL)小鼠脑组织和原代胶质细胞中Pdpn表达均有降低。这些结果提示,在无IDH突变胶质瘤中,野生型IDH1升高是促进Pdpn表达的重要原因。4)野生和突变型IDH1共同调控Pdpn基因启动子甲基化为了确定IDH1如何调控胶质瘤Pdpn的表达,我们在胶质瘤U251和U87分别过表达wtIDH1和/或突变型IDH1（mutant IDH1,muIDH1）。Western blot和qPCR显示,过表达wtIDH1能够显著增加胶质瘤细胞中Pdpn的表达,且muIDH1能够抑制由wtIDH1诱导的Pdpn高表达。进一步,利用荧光素酶报告系统,我们发现wtIDH1能够增加Pdpn基因启动子的转录活性,且muIDH1能够抑制由wtIDH1诱导的Pdpn基因启动子的高转录活性。此外,我们还发现Octyl-2-HG和D-2-HG也能够抑制原代胶质细胞和过表达wtIDH1的U251细胞中Pdpn的表达,且存在剂量依赖关系。荧光素酶报告系统也显示,二者能够抑制表达wtIDH1细胞中的Pdpn基因启动子的高转录活性。很多研究显示,启动子的甲基化修饰参与了Pdpn的转录调控,我们发现在IDH突变胶质瘤中Pdpn基因启动子CpG岛甲基化水平显著升高,而无IDH突变胶质瘤中Pdpn启动子甲基化水平显著降低。在体外,过表达wtIDH1能够显著降低Pdpn启动子的甲基化,而muIDH1却导致Pdpn启动子的高甲基化。由于wtIDH1并不产生D-2-HG,但能够催化异柠檬酸（isocitrate）转变为α-KG,而α-KG是DNA去甲基化酶的共因子（co-factor）。定量分析发现,在IDH突变的胶质瘤中α-KG含量显著降低,而且过表达wtIDH1能够增加细胞内α-KG含量,但muIDH1能够降低胶质（瘤）细胞中的α-KG含量。此外,Octyl-2-HG和D-2-HG能够促进Pdpn启动子的高甲基化。这些结果提示,野生型IDH1通过增加细胞内α-KG水平,促进胶质瘤中Pdpn启动子的去甲基化,增加Pdpn表达,而突变型IDH1功能恰好相反。综上所述,IDH突变能够减少胶质瘤内α-KG水平,同时产生D-2-HG,其共同抑制α-KG依赖的双加氧酶,导致Pdpn基因启动子的高甲基化,降低胶质瘤Pdpn表达。Pdpn能够促进微血管中周细胞的覆盖,因此在IDH突变胶质瘤微血管中周细胞覆盖减少,从而影响胶质瘤的血管结构。本研究探讨了野生和突变型IDH1在胶质瘤中的作用和相互关系,确定了Pdpn在胶质瘤血管周细胞形成中的作用和调控机制。研究结果不仅有助于认识肿瘤中血管周细胞的形成和调控机制,也为深入研究细胞内关键代谢物在肿瘤的发生中的作用提供了实验基础。