阿维菌素优良菌株的选育和整合型vgb载体的构建与表达

来源 :沈阳药科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qq12441483
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阿维菌素是由阿维链霉菌产生的一类结构相似的十六元大环内酯类齐墩果糖双糖衍生物,在大规模高密度发酵中,氧的供应往往是影响细胞生长和产物产量的关键因素之一,因此溶氧成为阿维菌素产量提高的限制因素之一。本研究通过将透明颤菌血红蛋白(vgb)基因整合到阿维链霉菌基因组中,提高阿维链霉菌的摄氧效率、改善其生长状况,提高阿维菌素的产量。通过自然分离选育,筛选到了2株产阿维菌素能力较高且稳定的菌株:S-avermitilis62和S.avermitilis 64,其中B1a效价分别为547μg·mL-1和512μg·mL-1。应用双亲灭活原生质体融合技术选育阿维菌素高产菌株,得到了一株高产菌株S.avermitilisR08,阿维菌素总发酵单位达到了2889μg·mL-1,其中B1a主份达716μg·mL-1,分别较出发菌株S.avermitilis 62、S.avermitilis 64提高30.9%和39.8%。利用链霉菌随机整合质粒pSET152和带vgb的大肠埃希菌质粒pUC19-vgb,构建链霉菌随机整合质粒pLH1001,利用接合转移方法将pLH1001转化阿维链霉菌,利用安普霉素抗性筛选转化子。CO结合差光谱法分析结果表明:在420nm处有一吸收峰。说明转化子细胞中表达了血红蛋白,具有生物活性。采用二级发酵法,将阿维链霉菌(含或不含vgb基因)经种子瓶培养24h后,以7%(v/v)的接种量转接发酵摇瓶,7天后取出测定效价,发酵结果表明,转化子的效价较融合子的效价略低,可能是由于目的片段随机整合到链霉菌基因组中,导致产量下降。对转化子S.aveimitilisT3的发酵培养基进行优化。通过均匀设计优化发酵培养基配方,发酵培养基为:玉米淀粉10;黄豆饼粉0.4;花生饼粉0.6;酵母粉0.8;酵母膏0.20;玉米浆0.30,S.aveimitilisT3的总效价为3298μg·mL-1,其中B1a发酵产量达987μg·mL-1,比原来提高56.7%。
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