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KISS-1/GPR54系统由黑色素瘤转移抑制基因(KISS-1)表达产物亲吻素(kisspeptin)和其特异性G蛋白偶联受体54(G protein coupled receptor 54,GPR54)组成。kisspeptin通过调节下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的释放,进而影响促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)的分泌,对哺乳动物初情期的启动、发情周期、排卵等生殖活动发挥着重要的调控作用。甘加型藏羊生活在海拔3000m以上的高寒地区,是典型的季节性发情动物,每年一胎,每胎一羔,繁殖率低。目前有关KISS-1/GPR54系统是否直接影响甘加型藏羊季节性繁殖、发情周期等生殖活动及其分子调控机理等研究国内外未见报道。为阐明甘加型藏羊发情周期KISS-1/GPR54在生殖活动中的作用,本研究首次系统对甘加型藏羊发情周期不同阶段下丘脑-垂体-卵巢轴(Hypothalamus-pituitary-ovary axis,HPOA)组织中KISS-1/GPR54基因、蛋白表达和分布的动态变化规律进行了研究。试验选取体态健康且空怀的处于发情周期的甘加型藏羊32只,分为发情期、发情后期、间情期和发情前期4组,每组8只进行实验。判定发情后,在发情周期各时期分别采取下丘脑、垂体、卵巢组织。(1)采用qRT-PCR方法,检测甘加型藏羊发情周期HPOA组织中KISS-1/GPR54 mRNA表达量的动态变化;(2)应用免疫组织化学法,结合计算机图像分析软件(Image pro-plus),分析研究了甘加型藏羊发情周期HPOA组织中kisspeptin/GPR54免疫阳性细胞数量、分布及免疫阳性产物的积分光密度值;(3)采用蛋白免疫印迹法对甘加型藏羊发情周期HPOA组织中kisspeptin/GPR54蛋白表达进行定量检测分析。研究结果如下:1.qRT-PCR结果显示:甘加型藏羊发情周期各时期下丘脑、垂体、卵巢组织中均有KISS-1、GPR54 mRNA表达,且表达量存在差异:(1)下丘脑组织中KISS-1、GPR54 mRNA的相对表达量分别于发情前期和发情期最高,显著高于其它发情时期(p<0.05);(2)垂体组织中KISS-1、GPR54 mRNA相对表达量均于发情前期显著高于其它发情时期(p<0.05);(3)卵巢组织中KISS-1、GPR54mRNA相对表达量分别于间情期和发情后期最高,显著高于其它时期(P<0.05)。结果表明KISS-1/GPR54 mRNA在甘加型藏羊发情前期至发情期对下丘脑和垂体功能活动调节作用强,对卵巢的调节作用主要集中在发情期至发情后期。2.免疫组织化学染色结果显示:甘加型藏羊发情周期各时期下丘脑、垂体、卵巢组织中均有kisspeptin、GPR54免疫阳性细胞分布的表达。其中(1)下丘脑中kisspeptin免疫阳性产物主要表达在神经细胞和锥体细胞的胞质中,GPR54免疫阳性细胞的分布除上述反应区域外,部分颗粒细胞的核膜上也检测出阳性产物。(2)垂体组织中kisspeptin和GPR54免疫阳性产物主要分布表达在嗜碱性细胞的胞质中。(3)卵巢中的kisspeptin和GPR54免疫阳性产物在发情前期主要于卵泡细胞、卵泡膜上有少量表达;发情期则主要在颗粒层和卵泡膜内层为高表达;进入发情后期和间情期,主要在颗粒层、卵泡内膜和卵泡外膜上表达,尤其在卵泡外膜的表达量增加。下丘脑和垂体组织中的kisspeptin免疫阳性产物的平均积分光密度值均于发情前期最高,显著高于其它发情时期(P<0.05),GPR54分别于发情期和发情前期最高;卵巢中kisspeptin/GPR54分别于发情前期和发情期最高,与间情期的表达差异显著(P<0.05)。3.蛋白免疫印迹结果显示:甘加型藏羊整个发情周期下丘脑、垂体、卵巢组织中均有kisspeptin和GPR54蛋白的表达,且不同发情时期的表达量具有差异。(1)下丘脑和垂体组织中kisspeptin、GPR54蛋白表达量均于发情前期最高,显著高于其它发情时期(P<0.05);(2)卵巢组织中kisspeptin和GPR54表达量分别于发情后期和发情前期达到最高,显著高于其它发情时期(P<0.05)。表明kisspeptin/GPR54蛋白对下丘脑和垂体组织的功能调节主要依赖于kisspeptin的高表达,kisspeptin主要在发情后期对卵巢功能调节作用强。结论:(1)甘加型藏羊发情周期各时期HPOA组织中均有kisspeptin/GPR54免疫阳性细胞和KISS-1/GPR54 mRNA及其蛋白分布表达,说明kisspeptin/GPR54对甘加型藏羊HPOA功能活动有重要调节作用。(2)KISS-1/GPR54系统对甘加型藏羊HPOA功能活动的调节主要依赖于kisspeptin的高表达,在藏羊发情前期至发情期kisspeptin对下丘脑和垂体功能活动调节作用强,对卵巢的调节作用主要在发情期及发情后期。